分光光度法測定茯苓中多糖的含量

1、分光光度法測定茯苓中多糖的含量導讀 茯苓多糖的提取純化 取新鮮茯苓，去表皮，切塊，干燥，粉碎，過60目篩得茯苓粉末熊婧1   於小波2（1 武漢健民藥業(yè)集團股份有限公司  湖北武漢  430052）（2 馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司  湖北武漢  430064）【摘要】目的  建立茯苓中多糖的含量測定方法，分析不同產地和不同菌種培育茯苓中的多糖含量，為茯苓藥材質量控制和評價提供參考。方法  采用分光光度法，苯酚-硫酸法顯色，檢測波長490nm。結果  葡萄糖在40200µg/ml范圍內線性良好，r

2、=0.9999，平均回收率為99.72%，RSD為0.99%（n=6）。不同產地和不同菌種培育茯苓中的多糖含量差異較大。結論  本方法簡便快速、準確可靠、重復性好，可用于茯苓藥材的質量控制。【關鍵詞】分光光度法  茯苓  茯苓多糖  含量測定【中圖分類號】R927.2                       【文獻標識碼】B 

3、;                              【文章編號】2095-1752（2012）18-0310-02        茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具利水滲濕、健脾、寧心

4、之功效，主要用于水腫尿少、痰飲眩悸、脾虛食少、便溏泄瀉、心神不安、驚悸失眠等癥1。研究表明，茯苓中含有多糖類、萜類、甾體類、蛋白質等多種化合物，其中，多糖類化合物在該藥材中含量甚高，具有抗炎癥、抗氧化損傷和免疫調節(jié)等多個方面的生物活性，一直備受各國研究者的重視2。在現行中國藥典2010年版一部茯苓藥材標準中，尚無含量控制指標，故筆者采用分光光度法建立茯苓多糖含量測定方法，為茯苓藥材質量控制和評價提供參考。        1  儀器與試藥      

5、0; 1.1 儀器  SHIMADZU UV-2041PC紫外-可見分光光度計，METTLER TOLEDO AL204型電子天平（萬分之一），電子控溫水浴鍋等。        1.2 試藥  茯苓樣品分別采自湖北、安徽、云南等20個省區(qū)及28個不同菌種培育的茯苓藥材，經湖北省中醫(yī)藥研究院王克勤教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf；濃硫酸、苯酚（分析純）、葡萄糖標準品（購于中國食品藥品檢定研究院，原中國藥品生物制品檢定所）、水（重蒸餾水）；其他試劑均為分析純。 

6、       2  方法與結果        2.1  茯苓多糖的提取純化  取新鮮茯苓，去表皮，切塊，干燥，粉碎，過60目篩得茯苓粉末。取茯苓粉末約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加25ml石油醚于70水浴中回流2h，冷卻，過濾，濾渣干燥后加0.1mol/LNaOH溶液100ml，攪拌1h（5)，以3500r/min離心15 min，取上清液。上清夜用10%冰醋酸溶液調pH值56，使其成糊狀，離心，棄上清夜，殘留物置透析袋中，用蒸餾水

7、洗滌12h，離心得白色膠狀沉淀，即為茯苓多糖。        2.2  供試品溶液的制備  取茯苓樣品按2.1項下方法制得茯苓多糖，將其置200ml量瓶中，加水溶解至刻度，緩慢攪勻，精密量取0.5ml，置10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。        2.3  對照品溶液的制備  取葡萄糖標準品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加水制成每1ml含200g的溶液，作為貯備液，即得。   

8、     2.4  測定法  取對照品或供試品溶液1.0ml，加入5%苯酚溶液1.75ml，搖勻，緩慢加入濃硫酸6.0ml，迅速搖勻，室溫放置40min，在紫外-可見分光光度計490nm的波長處測定吸光度。        2.5  線性關系考察  分別精密量取40、80、120、160、200µg/ml的對照品溶液2.0ml，按2.4項下測定法測定吸光度，以濃度（C）對吸光度（A）進行線性回歸，得回歸方程為A=0.0044C +0.02

9、56（r=0.9999），葡萄糖在40200µg/ml范圍內線性良好。        2.6  精密度試驗  精密量取對照品溶液1.0ml，按2.4項下測定法測定吸光度5次，吸光度依次為0.439、0.437、0.437、0.438、0.438，RSD=0.19%（n=5），表明儀器精密度良好。        2.7  穩(wěn)定性試驗  精密量取供試品溶液1.0ml，于0、1、2、4、8、24h，按2.4項下測

10、定法測定吸光度，吸光度依次為0.437、0.438、0.439、0.439、0.439、0.441，RSD=0.31%（n=6），表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。        2.8  重復性試驗  精密量取供試品溶液各1.0ml，共5份，按2.4項下測定法測定吸光度，吸光度依次為0.436、0.445、0.436、0.427、0.443，RSD=1.48（n=5），表明本方法重現性良好。        2.9  加樣回

11、收率試驗  取已知含量的茯苓樣品粉末6份，每份0.25g，精密稱定，分別精密加入葡萄糖標準品約0.15g，按2.2項下方法制成供試品溶液，再按2.4項下測定法測定，平均回收率為99.72%，RSD為0.99%，表明本方法準確度良好。結果見表1。         3  討論        3.1 多糖類成分常用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、碘量法等測定含量，但由于蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性較差，線性關系不理想，重現性、穩(wěn)定性所測數據差異較

12、大，且蒽酮試液穩(wěn)定性也較差，需臨時配制，特別是加熱后最大吸收峰偏移較大3；碘量法操作麻煩，且結果一般不夠理想4，而苯酚-硫酸法是利用硫酸將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚溶合成有色的化合物，即為橙黃色溶液，且顏色穩(wěn)定，在適當波長處（490nm）有特征吸收，可測定多糖含量5，故筆者選用苯酚-硫酸法研究建立茯苓多糖的含量測定分析方法，結果表明該方法簡便快速、準確可靠、重復性好。        3.2 在測定波長的選擇上，筆者分別將對照品和供試品溶液于紫外-可見分光光度計300700nm之間進行掃描，兩者均在4

13、90nm處吸光度最大，故選擇490nm為測定波長。        3.3 在顯色條件選擇上，筆者分別以加入5%苯酚溶液0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00ml考察苯酚用量，緩慢加入濃硫酸4.0、5.0、6.0、7.0、8.0ml考察濃硫酸用量，置于20、30、40、50、60的水浴和室溫（約25）中考察顯色溫度，放置20、30、40、50、60min后測定考察顯色時間，結果以5%苯酚溶液加入量為1.75ml，濃硫酸加入量為6.0ml，在室溫下反應40min為最佳測定條件。         3.4 根據不同產地和不同菌種培育茯苓中多糖含量測定結果（見表2、表3），不同產地和不同菌種培育茯苓中多糖含量差異均較大，表明產地生態(tài)環(huán)境、菌種來源對茯苓中多糖含量的高低均有著重要影響。進一步分析可知，無論產地還是菌種來源，以湖北、湖南、安徽茯苓中多糖含量較高，而福建、四川茯苓中多糖含量較低。表1  加樣回收率試驗結果(n=6)參考文獻 1 國家藥典委員會中華人民共和國藥典（2010年版一部）S北京：中國醫(yī)藥科技出版社，20