DNA重組、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化

1、DNA重組、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化DNA1組DNAS組基因重組是指,由不同DNA連的斷裂和連接而產生DNA>t段的交換和重新組合,形成新DN心子的過程.原核生物的基因重組有轉化、轉導和接合等方式.受體細胞直接吸收來自供體細胞的DNAt段,并使它整合到自己的基因組中,從而獲得供體細胞局部遺傳性狀的現象,稱為轉化.通過噬菌體媒介,將供體細胞DNAt段帶進受體細胞中,使后者獲得前者的局部遺傳性狀的現象,稱為轉導.自然界中轉導現象較普遍,可能是低等生物進化過程中產生新的基因組合的一種根本方式.高等動植物中的基因重組通常在有性生殖過程中進行,即在性細胞成熟時發(fā)生減數分裂時同源染色體的局部遺

2、傳物質可實現交換,導致基因重組.基因重組是雜交育種的生物學根底,對生物圈的繁榮興盛起重要作用,也是基因工程中的關鍵性內容.基因工程的特點是基因體外重組,即在離體條件下對DN份子切割并將其與載體DNA分子連接,得到重組DNA并將其導入到受體中微生物或高等動植物,從而使受體獲得某些有益性狀.1977年美國科學家首次用重組的人生長激素釋放抑制因子基因生產人生長激素釋放抑制因子獲得成功.此后,運用基因重組技術生產醫(yī)藥上重要的藥物以及在農牧業(yè)育種等領域中取得了很多成果.質粒把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術,送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體Vector.YAGBAC噬菌體、細菌質粒等

3、是重組DN破術中常用的載體.一個理想的克隆載體大致應有以下一些特性：1分子量小、多拷貝、松馳限制型；2具有多種常用的限制性內切酶的單切點；3能插入較大的外源DNA>t段；4具有容易操作的檢測表型.質粒Plasmid是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DN附子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中.質粒主要發(fā)現于細菌、放線菌和真菌細胞中,它具有自主復制和轉錄水平,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數,弁表達所攜帶的遺傳信息.質粒的復制和轉錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質,如離開宿主細胞那么不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活.質粒的存在使宿主具有一些額外的

4、特性,如對抗生素的抗性等.F質粒又稱F因子或性質粒、R質?？顾幮砸蜃雍虶ol質粒產大腸桿菌素因子等都是常見的天然質粒.質粒載體是在天然質粒的根底上為適應實驗室操作而進行人工構建的.與天然質粒相比,質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因如抗生素抗性基因和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量盡可能減少,以便于基因工程操作.大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列,這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產生用于序列測定的單鏈DNA體外轉錄外源DNA列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等.常用的質粒載體大小一般在1kb至10k

5、b之間,如PBR322PUC系歹hPGE陳列和pBluescript簡稱pBSS等.質粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點.如果要克隆較小的DNA片段V10kb且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好.本實驗中應用T載體轉化受體菌E.coliDH5a的菌株.由于T載體上帶有Ampr和lacZ基因,故重組子的篩選采用Am而性篩選與a-互補現象篩選相結合的方法.因T載體帶有Ampr氨芾青霉素耐受基因,故轉化受體菌后只有帶有T載體DNA的轉化子才能在含有Amp氨芾青霉素的LB平板上存活下來；而未獲得轉化的空細菌那么不能存活.此為初步的抗性篩選.T載體上帶有B-半乳糖甘酶基因lacZ的調控序列和B-半乳糖音酶

6、N端146個氨基酸的編碼序列.這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點,但弁沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能.E.coliDH5a菌株帶有B-半乳糖甘酶C端局部序列的編碼信息.在各自獨立的情況下,T載體和DH5a編碼的B-半乳糖甘酶的片段都沒有酶活性.但在T載體和DH5a融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質.這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的S-半乳糖甘酸陰性突變體之間實現互補的現象叫a-互補.由a-互補產生的Lac+細菌較易識別,它在生色底物X-gal(5-澳-4氯-3-呷噪-B-D-半乳糖昔)的存在下被IPTG(異丙基硫代-B-D-半乳糖甘)誘導形成

7、藍色菌落.當外源片段插入到T載體質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變,表達蛋白失活,產生的氨基酸片段失去a-互補水平,因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養(yǎng)基上只能形成白色菌落.在LB培養(yǎng)基上,a-互補產生的Lac+細菌由于含B-半乳糖甘酶,能分解LB培養(yǎng)基中的X-gal,產生藍色菌落,而當外源片段插入后,失去廠互補水平,因而不產生B-半乳糖甘酶,無法分解培養(yǎng)基中的X-gal,菌落呈白色.由此可將重組質粒與自身環(huán)化的載體DNA分開.此為a-互補現象篩選.注：X-gal是5-澳-4-氯-3-回噪-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galac

8、toside)以半孚L糖昔酶(b-galactosidase)水解后生成的阻噪衍生物顯藍色.IPTG是異丙基硫代半乳糖昔(Isopropylthiogalactoside),為非生理性的誘導物,它可以誘導lacZ的表達.連接策略外源DNA>t段和質粒載體的連接反響策略有以下幾種：(1)帶有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶處理質粒和外源片段,即可得到這樣的末端.但是在連接反響中值得注意的是,由于質粒和外源片段本身可能含有兩個相同粘性末端,因此均可能發(fā)生質粒的自身環(huán)化或外源片段形成的寡聚物,而且正反兩種連接方向都可能有.所以,必須在實驗方案中盡可能保證正確連接產物的數量到達最高,同時需進行后

9、續(xù)陽性克隆的篩選.帶有非互補粘性末端用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆的DN四段,一般情況下,常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點,因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體,從而將外源片段定向地克隆到載體上.也可在PCRT增時,在DNAt段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連.(3)帶有平末端是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生,或由DNA聚合酶補平所致.由于在連接反響中,平端的連接效率比粘性末端要低得多,故使用T4DNA1接酶的濃度和外源DNAR載體DNA濃度均要高得多.通常還需參加低濃度的聚乙二醇

10、(PEG8000)以促進DN份子凝聚成聚集體的物質以提升轉化效率.特殊情況下,外源DN附子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,那么可以在線狀質粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配,也可以有限制的使用E.coliDN課合酶I的klenow大片段局部填平3'凹端,使不相匹配的末端轉變?yōu)榛パa末端或轉為平末端后再進行連接.轉化轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的根本實驗技術.轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,

11、即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(R,M-),它可以容忍外源DN心子進入體內并穩(wěn)定地遺傳給后代.受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2,RbCl等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenentcells).進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀.將經過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA子的受體細胞).目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細胞轉化效率較高

12、,但CaCl2法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,可參加占總體積15%的無菌甘油于-70C保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛.為了提升轉化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：(1)細胞生長狀態(tài)和密度：不要用經過屢次轉接或儲于4c的培養(yǎng)菌,最好從-70C或-20C甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液.細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好,密度過高或缺乏均會影響轉化效率.(2)質粒的質量和濃度：轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA量過多或體積過大時,轉化效率就會降低.一般情況下,1ng的DNA即可使50

13、"的感受態(tài)細胞到達飽和,同時DNA容液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%.(3)試劑的質量：所用的試劑,如CaCb等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于枯燥的冷暗處.(4)預防雜菌和雜DNA勺污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿、離心管等需經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌或過濾除菌,且注意防止被其它試劑、DNAS或雜DNA)f污染.本實驗方案本實驗以E.coliDH5a菌株為受體細胞,并用CaCb處理,使其處于感受態(tài)(本實驗購置了商品化的感受態(tài)),然后與pBS質粒共彳溫,實現轉化.由于pBS質粒帶有氨芾青霉素抗性基因(Ampr),可通過Am

14、p抗性來篩選轉化子.如受體細胞沒有轉入pBS,那么在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長.能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細胞(轉化子)肯定已導入了pB4帶有插入片段的轉化子由于破壞了半乳糖甘酶基因,呈白色；不帶外源片段的轉化子可以分解X-gal,呈蘭色.將白色轉化子挑出后擴大培養(yǎng),PCR鑒定后進一步酶切鑒定.一、試劑材料及設備試齊ij:X-gal儲液(20mg/ml),IPTG儲液(200mg/ml),LB液體培養(yǎng)基,0.1mol/L的CaCl2溶液,Am滑液,含Amp的LB固體培養(yǎng)基,含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基,pMD18-Tvector;注：具體配方見實驗六后附錄材料：外源DNAt段：一一PC

15、R屯化回收產物,載體DNA-pBS質粒(Ampr,lacZ),E.coliDH5a一株R-,M",Amp)"設備：恒溫搖床,臺式高速離心機,恒溫水浴鍋,瓊脂糖凝膠電泳裝置,電熱恒溫培養(yǎng)箱,電泳儀,無菌工作臺,微量移液槍,eppendorf管,低溫冰箱,制冰機,分光光度計二、實驗步驟及考前須知(一)連接反響1、樣品混勻冰上溶解solutionI、vector及重組DNAt段等,渦旋混勻并短暫離心.2、配制連接體系按以下順序在參加各種成分,建立連接反響.成分體積vector0.5l純化產物4.5lTotal5itl注：純化產物白使用量0.1pmol-0.3pmol;3、參加So

16、lutionISolutionI的體積為5l,輕輕吹吸混勻.4、連接反響16C連接30min水浴或PC做進行.二感受態(tài)細胞的制備CaCl2法1、受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5a單菌落,接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中,37C下振蕩培養(yǎng)12小時左右過夜,直至對數生長后期；將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于50mlLB液體培養(yǎng)基中,37C300轉振蕩培養(yǎng)3小時至OD600=0.5左右O2、收集菌體將5ml培養(yǎng)液轉入預冷的離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4c下4000轉離心10分鐘.3、CaCl2懸浮細胞,制備感受態(tài)棄上清,用預冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1m

17、l輕輕懸浮細胞,4c下4000r/min離心10分鐘.棄去上清,倒出培養(yǎng)液,將管倒置幾秒鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡.參加0.2ml預冷0.1mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細胞,轉入1.5ml離心管,冰上放置20分鐘,即成感受態(tài)細胞懸液.4、感受態(tài)細胞凍存3中用含15%t油的0.1mol/L的CaCl2溶液代替普通預冷CaCl2溶液,重懸細胞,即可貯存于-70C可保存半年.使用時從-70C冰箱中取出感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍解凍后立即置冰上.三轉化1、 混合冰上迅速解凍感受態(tài)細胞,取50以l+重組DNA5以J用手指輕彈混勻；置于冰上,靜置30min,使二者充分結合；注：1解凍感受態(tài)

18、細胞,動作要快；以免影響細胞轉化效率；2重組DNA質粒解凍后,混勻,瞬間離心再??；3質粒含量不宜過多,一般不超過50ng,體積不超過10詞4感受態(tài)細胞和DNA混勻時不要用槍吹打,以免影響細胞轉化效率；2、 熱擊42c水浴,熱擊45秒,后迅速置于冰上冷卻2-3分鐘,過程中不要搖動離心管.注：1熱擊操作使DNA4入感受態(tài)細胞；2不同感受態(tài)細胞,熱擊時間亦有所不同；3冰上迅速冷卻,使得DN3感受態(tài)中穩(wěn)定；3、 菌的增殖參加不含抗生素Amp的LB液體培養(yǎng)基500浮混勻,37C振蕩1小時轉速為200轉/分.注：此步驟主要是為了使細菌恢復正常生長狀態(tài),并表達質粒編碼的抗生素抗性基因.4、 鋪板取100皿的

19、菌液加到含Amp及IPTG4ul/X-gal40ul的篩選平板上,用涂布棒小心涂布均勻；室溫正置1小時左右,使菌液完全被培養(yǎng)基吸收；注：1含Amp及IPTG/X-gal的篩選平板需要事從冰箱中取出,倒置,使之恢復室溫；2涂布的菌液量要適當,以免形成的菌落密度過密或過稀,不利于后續(xù)挑菌.5、 過夜培養(yǎng)倒置培養(yǎng)皿,37C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜.注：1倒置培養(yǎng)是預防冷凝水浸潤到培養(yǎng)基中；2靜置培養(yǎng)時間不宜過長,時間過久會出現“衛(wèi)星菌落附錄：試劑配方1、X-gal儲液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液,包以鋁箔或黑紙以預防受光照被破壞,儲存于-20C.2、IPTG

20、儲液(200mg/ml):在800"蒸儲水中溶解200mgIPTG后,用蒸儲水定容至1ml,用0.22以m濾膜過濾除菌,分裝于eppendorf管并儲于-20C.3、含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50以g/mlAmp的LB平板外表加40以lX-gal儲液和4以lIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,備用.4、Am滑液：配成50mg/ml水溶液,-20C保存?zhèn)溆?5、含Amp的LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加15g瓊脂粉,高壓滅菌.冷卻至60c左右,參加Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板.6、0.1mol/L的CaCl2溶液：溶于重蒸水中,定容后過

21、濾滅菌.7、LB液體培養(yǎng)基(20g/L):LB固體粉末20g,參加1L自來水,溶解后高壓滅菌.8、質粒重組試劑盒：pMD18-Tvector(TaKaRa實驗七重組克隆的藍白斑篩選一、材料與試劑試劑：含重組DN明段的E.coliDH5a菌株,Am陰液50mg/ml水溶液,LB液體培養(yǎng)基,PCR式劑J盒儀器：牙簽、恒溫搖床,臺式高速離心機,恒溫水浴鍋,瓊脂糖凝膠電泳裝置,電熱恒溫培養(yǎng)箱,電泳儀,無菌工作臺,微量移液槍,eppendorf管,低溫冰箱二、實驗步驟與考前須知1、陽性克隆篩選取過夜倒置培養(yǎng)的平板,觀察平板：是否出現明顯而又未相互重疊的單菌落注：1如果未出現菌落或菌落較小,可以延長培養(yǎng)時

22、間.2在含X-gal和ITPG的LB培養(yǎng)基上,帶有插入片段的重組質粒轉化子,應呈現白色菌落,由于插入片段破壞了原載體中B-半乳糖甘酶活性；帶有空載體的轉化子,由于具有B-半乳糖甘酶活性,為藍色菌落；不帶有質粒載體DNA勺細胞,由于無Am詆,性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活.2、挑陽性菌用牙簽隨機挑取白色重組菌,沾至含有Am航生素1ml液體LB培養(yǎng)基中,37度培養(yǎng)過夜轉速200轉/分.3、菌落PCR5分鐘1菌液模板的獲取取0.2ml過夜培養(yǎng)的菌液于1.5ml離心管中,沸水浴12000rpm,離心3分鐘.2配制PCR體系253模板：取2山清作為模板；引物：pGE-TVector多克隆位點兩側

23、的序列；或從基因組中擴增出片段時所用的引物.反響體系：組分工作濃度體積終濃度10XBuffer2.51XdNTP(10mM)0.53200HM引物(上下游2口0.2四2.59菌液2口100ngTaq(5U/")0.25111.25U滅菌ddH2O補齊3)PCR反響條件94C預變性2分鐘94C久生30秒57C退表30秒28cycles72C延伸30秒72C延伸5分鐘4)電泳取10HlPCFJTW,參加上樣緩沖液,1.5%瓊脂糖電泳檢測插入片段的大小是否與目的基因一致.實驗八質粒DNA勺提取、酶切及電泳檢測質粒DNA勺提取與電泳根本步驟培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞；別離和純化質粒D

24、NA實驗原理采用十二烷基磺酸鈉(SDS)或TritonX-100可使細胞膜裂解.經SDS或TritonX-100處理后,細菌染色體DNA纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段.當用強熱或酸、堿處理時,細菌的線性染色體DNA變性,而共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開,當外界條件恢復正常時,線狀染色體DNA片段難以復性而與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起,質粒DNA雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中.電泳檢測在細

25、菌細胞內,共價閉環(huán)質粒以超螺旋形式存在.在提取質粒過程中,除了超螺旋DNA外,還會產生其它形式的質粒DNA如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(OpencircularDNA,簡稱ocDNA);如果質粒DNA勺兩條鏈在同一處斷裂,那么形成線狀DNA(LinearDNA).當提取的質粒DNA電泳時,同一質粒DNA具超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快.酶切鑒定能特異地結合限制性酶識別的DN峙列之內或其附近的特異位點上,弁切割雙鏈DNA如EcoRI切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端.5-GJAATTC3&#

26、39;5'GAATTC3'3-CTTA4G5-3'CTTAAG-5'酶切反響影響因素DNA屯度、緩沖液、溫度條件及限制性內切酶本身都會影響酶切反響的效率.DNA大局部限制性內切酶不受RNA或單鏈DNA的影響.當他量的污染物進入限制性內切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內切酶時,每次都要用新的吸管頭.緩沖液：如果采用兩種限制性內切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度.假設兩者可用同一緩沖液,那么可同時水解.假設需要不同的鹽濃度,那么低鹽濃度的限制性內切酶必須首先使用,隨后調節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內切酶水解.也可在第一個酶切反響完成后,用

27、等體積酚/氯仿抽提,加0.1倍體積3mol/LNaAc和2倍體積無水乙醇,混勻后置-70C低溫冰箱30分鐘,離心、干燥弁重新溶于緩沖液后進行第二個酶切反響.酶切圖譜DNA艮制性內切酶酶切圖譜又稱DNA勺物理圖譜,它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成,以直線或環(huán)狀圖式表示.在DNA歹U分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA勺無性繁殖、基因文庫的構建等工作中,建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié),近年來開展起來的RFLP版制性片段長度多態(tài)性)技術更是建立在它的根底上.在酶切圖譜制作過程中,為了獲得條帶清楚的電泳圖譜,一般DN麗量名勺為0.5-1以g.限制性內切酶的酶解反響最適條件各不相同

28、,各種酶有其相應的酶切緩沖液和最適反響溫度(大多數為37C)O對質粒DNA酶切反響而言,限制性內切酶用量可按標準體系1以gDN劭口1單位酶,消化1-2小時.但要完全酶解那么必須增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反響時間也要適當延長.一、試劑1、溶液I：50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0).溶液I可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌(6.895*104Pa)15分鐘,儲存于4c冰箱.2、溶液II:0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋),1%SDS.3、溶液田：5mol/LKAc60ml,冰

29、醋酸11.5ml,H2O28.5ml,定容至100ml,并高壓滅菌.溶液終濃度為:K+3mol/L,Ac-5mol/L.4、RNase酶10mg/ml5、STE0.1mol/LNaCl,10mmol/LTrisCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0).二、實驗步驟與考前須知1、接菌用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基含50以g/mlAmp中,37C振蕩培養(yǎng)約12小時至對數生長后期.后續(xù)步驟2-4為質粒DNA量快速提取堿法該方法對于從大量轉化子中制備少量局部純化的質粒DNA十分有用.這些方法共同特點是簡便、快速,能同時處理大量試樣,所得DNAt一定純度,可滿足限制酶切割

30、、電泳分析的需要.注：提取過程保持低溫稍好.2、菌體的收集取5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中屢次離心在同一管中進行,將沉淀一并收集,12000g離心30秒.棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數分鐘,使液體流盡.注：菌液量要適當,太少可能無法保證后續(xù)實驗要求,太多會使裂解提取步驟不夠充分.3、菌體裂解1洗滌菌體用1mlSTE重懸洗滌菌體,離心,12000g離心30秒,收集菌體.重復用STE漂洗菌體.注：洗滌的目的在于除去培養(yǎng)基中菌株細胞壁成分,以免其抑(2)參加溶液I使菌體充分裂解菌體沉淀重懸浮于200溶液I中,劇烈振蕩,使菌體充分裂解.(3)參加溶液n變性DNA參加新配制的溶液n300以l,蓋緊管口,快速溫和顛倒eppendorf管6-8次,此時溶液變澄清