維生素C生產(chǎn)現(xiàn)狀及應(yīng)用研究2(一)

1、維生素c生產(chǎn)現(xiàn)狀及應(yīng)用研究1引言維生素C（簡寫為VC）,又名L2抗壞血酸，化學名稱為L232氧代蘇乙糖醛酸內(nèi)酯，CA記錄號為50-81-7,分子式為C6H8O6oVC是1種重要的維生素類藥物，可用于預防、醫(yī)治疾病，還可作為強化劑和抗氧化劑大量用于食物行業(yè)中。近些年，VC在飼料方面的應(yīng)用進展也很迅速。另外，VC在化學工業(yè)中可用作聚合物的增進劑及調(diào)節(jié)劑。隨著人們對VC研究的深切和對其新用途的開發(fā),VC的需求量將會與日俱增。2應(yīng)用情形醫(yī)療上的應(yīng)用Vc是人體不能合成的維生素，也是人類生存不可缺少的營養(yǎng)要素之一。Vc的作用較復雜，它參與人體內(nèi)的氧化還原進程，參與氨基酸的代謝、神經(jīng)遞質(zhì)合成和細胞間質(zhì)膠原蛋

2、白的合成。它能增加組織中的環(huán)磷腺昔、環(huán)磷鳥昔的含量，增強機體的抗病能力和解毒功能，改善肝功能。Vc還具有降血脂、加速血液凝固、抗組胺和阻止致癌物質(zhì)亞硝胺生成的作用。臨床上Vc用途很多，可防治壞血病、細菌感染性疾病、病毒感染性疾病、動脈粥樣硬化醫(yī)治高血壓、克山病心源性體克、肝臟疾病、膽絞痛、貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癱、過敏性疾病和膠原病、銀屑病、氟骨癥、膚氨酸尿石癥、剝脫性角質(zhì)松解癥、色素沉著、黃褐斑能增進骨折愈合、傷口愈合、防治癌癥，還可用于甲亢、神經(jīng)病、糖尿病等的輔助醫(yī)治。目前Vc已被收入美、英、法、德、日等多國藥典和歐洲、國際藥典,中國藥典1995年版也收載了Vc原料藥和片劑，泡騰片、顆

3、粒劑、注射液等四種制劑。食物中的用途最近，一些科學家提出了“世紀營養(yǎng)新概念”，過去人們的膳食以預防營養(yǎng)不足為目標，而此刻則應(yīng)以預防疾病、強身建體為起點。美國保羅拉勒斯教授說:由于外界因素，諸如輻射、抽煙、空氣污染、過度勞累、微生物感染等原因，人體內(nèi)部產(chǎn)生的“自由基”愈來愈多，這就需要富含抗氧化作用和含自由基消除劑的食物來阻止、抑制或結(jié)合那些致病因子，減弱自由基對人體的危害。具體作法是補充更多Vc及Ve等維生素。在西方國家中，Vc大量添加在各類食物和飲料中，用量專門大。如用于食物保鮮、貯藏、健康食物添加劑，人體營養(yǎng)劑，桔子汁、果凍、果醬的維生素強化劑及油脂的抗氧化等等。美國1995年消費的Vc中

4、，食物和飲料行業(yè)占35%,達到6000噸。1992年日本Vc消費量的用在食物和飲料行業(yè)中，英國等國對飲料、罐頭、面粉、面包、葡萄酒、飲料、牛奶制品等產(chǎn)品中添加Vc的量都作了詳細規(guī)定。3生產(chǎn)工藝進展萊氏法是1933年德國化學家Reichstein等發(fā)明的最先應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)VC的方式。該法以葡萄糖為原料，經(jīng)催化加氫制取D-山梨醇，然后用醋酸菌發(fā)酵生成L-山梨糖，再經(jīng)酮化和化學氧化，水解后取得2-酮基-L-古洛糖酸（2-KLG）,再經(jīng)鹽酸酸化取得VC。萊氏法生產(chǎn)的VC產(chǎn)品質(zhì)量好、收率高。由于生產(chǎn)原料廉價易患,中間產(chǎn)物的化學性質(zhì)穩(wěn)固，至今仍是許多國外VC生產(chǎn)商，如Roche公司、BASF/Takeda

5、公司和E.Merck公司等廠商采用的主要工藝方式?？墒侨R氏法也存在很多缺點，諸如生產(chǎn)工序多、勞動強度較大，利用大量有毒、易燃化學藥品，容易造成環(huán)境污染等。為此，自20世紀60年代起，各國學者一直致力于萊氏法的改良。CHiOHCHOD-茍會德D-士梨等CHnOHJ=OIHOCHH-JOHHO一J一HICH：OHL-止梨葬CH?OHCOOHCOOH2殳基L古龍酸維生素C萊氏法化學合成匚藝加氫酶菌氧化酮化D-葡萄糖生山梨醇»L-山梨糖&SO廣酮制氧化NaOH.O”KMnO4市4而曰丫+4褓雙丙酮L山梨14f雙丙酮工古龍酸糖酸化22-酮-L-古龍酸造化,維生素C萊氏法合成工藝線路二步

6、發(fā)酵法70年代初，我國第一研究出兩步發(fā)酵法，其先進性取得世界公認，它是以生物氧化進程代替萊氏線路的部份化學合成進程，進而合成維生素Co3.2.1發(fā)酵二步發(fā)酵法的生物轉(zhuǎn)化進程如下：D山梨醇“黑醋毓，山梨糖其中，D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖是由黑醋酸菌完成的，該工藝在萊氏法中就已利用，由于工藝成熟且生物轉(zhuǎn)化率高（98%以上），因此在二步發(fā)酵法中得以延用。3.2.2提取工藝二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以后，發(fā)酵液中僅含8%左右的2-KLG,而殘留菌絲體、蛋白質(zhì)、多糖或懸浮微粒等雜質(zhì)的含量卻很高。這給2-KLG的分離提純帶來了專門大困難，致使后處置費用占總本錢的比例較大。目前，V工業(yè)生產(chǎn)中常常利用的2-KLG的分

7、離提純方式有加熱沉淀法、化學凝聚法和超濾法。加熱沉淀法加熱沉淀法是2-KLG分離提純的傳統(tǒng)工藝，分離手腕較為掉隊。此工藝通用氫型樹脂，調(diào)pH至蛋白質(zhì)的等電點后加熱除蛋白。采用此匚藝會造成有效成份在高溫下降解損失，且發(fā)酵液直接通過樹脂柱，造成樹脂表面污染，降低樹脂的互換容量和收率。兩次通過樹脂柱帶進了大量水分，也增大了濃縮耗能?；瘜W凝聚法化學凝聚法是通過加入化學絮凝劑來除去蛋白質(zhì)、菌體、色素等雜質(zhì)，避免了加熱沉淀時有效成份的損失。季輝煌等采用化學凝聚法對VC發(fā)酵液進行預處置,使2-KLG的濾液質(zhì)量提高，提取前步收率提高,VC總收率提高以上。以殼聚糖為主凝劑，聚丙烯酰胺為助凝劑，通過化學凝聚法除蛋

8、白工藝。提取收率由原來的76%提高到82%,古龍酸優(yōu)級品率由原來的35%提高到60%,本錢比原來降低20%?？墒腔瘜W凝聚法也存在許多不足，比如在處置后的發(fā)酵液離心后所得的上清液中任然存在必然量的蛋白，若是發(fā)酵液染菌則處置效果更不明顯，上清液渾濁，嚴峻影響了產(chǎn)品的品質(zhì)和收率。另外，化學凝聚法在操作進程中也會對環(huán)境造成污染。超濾法超濾是一種新興的膜處置技術(shù)，此法具有操作方便、節(jié)能、不造成新的環(huán)境污染等長處，因此在2-KLG的分離提純中的應(yīng)用日趨普遍。此法與加熱沉淀法不同的是，可在常溫下操作，可減少有效成份的損失；在用膜除蛋白的進程中，無任何新的化學物質(zhì)加入，可減少對樹脂的污染和損耗，降低酸堿用量，

9、減少三廢排放。與化學凝聚法不同的是，在處置染菌的發(fā)酵液時仍可達到較好的處置效果。我國的東北制藥廠1995年從丹麥引進目前全國最大膜面積的平板超濾裝置后,2-KLG的分離提純本錢比原先的化學凝聚法節(jié)約了600萬元，其收率和生產(chǎn)的自動化、持續(xù)化程度也明顯提高。隨著新型膜材料技術(shù)的開發(fā)，如陶瓷膜、不銹鋼膜等的應(yīng)用，超濾法的應(yīng)用效果會有進一步的提高。同時，國內(nèi)外正在探索反滲透、納濾等后序處置新工藝的應(yīng)用，以完善工藝聯(lián)結(jié)。3.2.3轉(zhuǎn)化工藝無論是萊氏法仍是二步發(fā)酵法制得的2-KLG,目前在生產(chǎn)上都是通過化學反映進程轉(zhuǎn)化為VC。按照所選試劑的不同，二步發(fā)酵法可分為酸轉(zhuǎn)化法和堿轉(zhuǎn)化法。酸轉(zhuǎn)化法VC化學轉(zhuǎn)化生

10、產(chǎn)，自萊氏法成立以來就采用濃鹽酸催化2-KLG,一步制得VCo國外有關(guān)學者對此法進行了許多研究。印度AhmedbadTextile工業(yè)研究協(xié)會研究表明，在以飽和氯代始（如CHCL）、芳煌（如苯、甲苯）為溶劑，由2-KLG與濃鹽酸在6075C下反映46h,可制得純度為90%的粗VCo美國學者YODICE等于1985年報導了2-KLG與濃鹽酸在表面活性劑Me（CH2）5N+Me3Cl的甲苯溶液中反映，可制得純度超過99%的VCo酸轉(zhuǎn)化法工藝簡單，操作步驟少，但反映進程當選用濃鹽酸對設(shè)備侵蝕嚴峻。另外，由于在反映體系中引入了臨性溶劑或表面活性劑，使后期的分離造成不便堿轉(zhuǎn)化法我國VC生產(chǎn)廠家均采用堿法

11、轉(zhuǎn)化2-KLG生產(chǎn)VC。東北制藥總廠等生產(chǎn)單位將2-KLG與甲醇在濃硫酸催化下生成2-酮基-L-古龍酸甲酯，該酯在NaHCO3作用下發(fā)生內(nèi)酯化反映生成VC鈉鹽。該法避免了酸催化的上述缺點，且操作工藝簡單，反映條件溫和，適合于規(guī)?；a(chǎn)，可是在生產(chǎn)中的反映周期太長，甲醇單耗高。有些單位嘗試用CHQNa代替NaHCCh進行堿轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率可高達,但產(chǎn)品質(zhì)量較差，且甲醇鈉價錢貴，造成生產(chǎn)本錢較高。IIIVC鈉鹽制備VC所采取的主要方式是硫酸酸化法和樹脂互換法。硫酸酸化法操作簡單，但需妥帖控制甲醇的濃度和pH值，才能使硫酸鈉與VC得以分離。氫型離子樹脂互換法設(shè)備龐大，操作復雜，且需常常再生樹脂，增加了酸

12、耗，酸液大量排放容易對環(huán)境造成要挾。目前，人們正在踴躍探索利用雙極性膜(BipolarMembraneElectrodialysis,BME)來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸化工藝，其工作原理為：在直流電場作用下，雙極性膜中的水被離解成H+和OH-,H+替換VC鈉鹽中的Na+結(jié)合成離解度小的VC,原VC鈉鹽中的Na+在電場的作用下通過陽離子互換膜從VC鈉鹽中分離出來，并和OH-結(jié)合生成NaOH。雙極性膜電滲析法無需外加物料可將VC鈉鹽轉(zhuǎn)化成VC,進程簡單，能耗低，投資少，轉(zhuǎn)化率高，其副產(chǎn)品和NaOH稀溶液也可被有效利用，對環(huán)境無污染，有望應(yīng)用到實際生產(chǎn)中。葡萄糖直接發(fā)酵法不能以葡萄糖作為直接發(fā)酵原料是二步發(fā)酵法

13、的最大缺點之一。國外較早就開始了細菌串聯(lián)發(fā)酵前萄糖產(chǎn)生2-KLG的研究。Sonoyama研究發(fā)覺，歐文氏菌的突變株(Erwinia)可將D-葡萄糖氧化成為2,5-二酮基-D-葡萄糖酸，再經(jīng)棒狀桿菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬或葡萄球菌屬等其中的某些菌株還原成2-KLG?？紤]若能將歐文氏菌和棒狀桿菌相關(guān)的特性結(jié)合于一種微生物中，構(gòu)建VC基因工程菌，就可實現(xiàn)從D-葡萄糖到2-KLG的一步發(fā)酵。最近幾年來，基因工程菌的研究已成為世界上熱點課題之一，美國、瑞士、法國、日本等許多國家都著力開展了此方面的研究。1985年，美國Genentech公司Anderson等人成功地分離純化了棒桿

14、菌(Corynebacteriumsp.)ATCC31090的2,5-DKG還原酶，并分析了該酶N-端的40個氨基酸序列，用原位雜交法從部份基因文庫中挑選到一個基因片段，再以已知片段為探針取得了完整基因，最終該基因被重組到了另一株發(fā)酵生產(chǎn)菌草生歐文氏菌ATCC21998)中，得以有效表達，從而實現(xiàn)了從D-葡萄糖到2-KLG的一步發(fā)酵。該法的合成效率很低，只有5%左右，主如果由于合成2,5-DKG的3種關(guān)鍵酶D-3葡萄糖脫氫酶、D-葡萄糖酸脫氫酶、2-酮基-D-古龍酸脫氫酶(存在于周質(zhì)中)與2,5-DKG還原酶(存在于胞質(zhì))在細胞中所處位置的較大不同造成。后來Grindley等通過改良，將棒桿菌

15、的2,5-DKG還原酶的基因在上表達，將收率提高至49%。所有這些都為最終構(gòu)建基因工程菌打下了基礎(chǔ)。二步發(fā)酵法發(fā)酵條件優(yōu)化“二步發(fā)酵法”是在“萊氏法”一步發(fā)酵的基礎(chǔ)上繼續(xù)通過氧化葡萄糖酸桿®(Gluconobacteroxydans)(俗稱小菌)和其伴生菌芽胞桿菌(Bacillusspp.)(俗稱大菌)兩種菌株的混合發(fā)酵1-2生產(chǎn)Vc的前體物質(zhì)2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)。該方式在Vc生產(chǎn)中一直占據(jù)著主導地位。本實驗研究了混合菌系的發(fā)酵條件，優(yōu)化混合菌系的發(fā)酵工藝。1實驗材料菌種氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)(俗稱小菌)，蠟狀芽胞桿菌(Bacill

16、uscereus),龐大芽胞桿菌(Bacillusmegatherium)(俗稱大菌)。培育基種子培育基：L-山梨糖%,玉米漿,蛋白陳,尿素,KH2PO4%,MgSO4-7H2O%,CaCO3%,121滅菌3。1而11。一次投糖發(fā)酵培育基：L-山梨糖8%,玉米漿,尿素,MgSO4-7H2O%，消沫劑,酵母膏,(NH4)2SO4%,CaCOj%,121滅30min,分離培育基。2實驗方式種液的制備用適量無菌水洗斜面，然后取少量混菌液接種到250mL三角瓶培育48h,涂布到分離培育基平肌上，培育45d后大小菌搭配，然后在(30±1)°C條件下茄子瓶斜面培育4d,經(jīng)搖瓶擴大培育后

17、，最后接到10L不銹鋼種子罐中培育1824h,即為生產(chǎn)用種液。2-酮基L-古龍酸(2-KLG)濃度的測定碘量法測定。3實驗結(jié)果與分析起始糖濃度對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響起始糖濃度對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響起始糖濃度/%46810酸量/(mg/mL)轉(zhuǎn)化率/%發(fā)酵培育基中不同的L-山梨糖起始濃度能夠明顯地改變菌系大小菌之間的數(shù)量比例，有效地調(diào)節(jié)混合菌系的產(chǎn)酸代謝。表2中數(shù)聽說明，當發(fā)酵培育基中L-山梨糖的起始濃度為10%時產(chǎn)酸量最高，可是糖酸轉(zhuǎn)化率最低，這可能是因為太高的糖濃度會抑制菌體產(chǎn)酸。起始糖濃度為4%時，轉(zhuǎn)化率高達,可是在大生產(chǎn)中投糖量太低會造成其他資源的浪費，降低設(shè)備的有效利用率，提多發(fā)酵本錢。所以采

18、用8%的起始糖濃度最為適合。微元素對新菌系生長代謝的影響微量元素對菌系酸量的影響生長因子vB1Vb2Vb1+Vb2產(chǎn)酸量/(mg/mL)轉(zhuǎn)化率/%在發(fā)酵培育基中添加,%）混合后的VB1和VB2混合物要比添加等量的單一微量元素VB1%）或VB2%）對菌系產(chǎn)酸的影響大，使菌系對L-山梨糖的轉(zhuǎn)化率達到。這是因為它們能夠提高混合發(fā)酵中大小菌之間的協(xié)調(diào)性，增強菌體代謝活力。起始pH值對菌系產(chǎn)酸量的影響起始pH值對菌系產(chǎn)酸量的影響PH產(chǎn)酸量/(mg/mL)時間/h菌系發(fā)酵培育基起始pH值為時菌體產(chǎn)酸量最高，發(fā)酵周期短。可是最有利于大菌的生長，有利于小菌的生長，若是在發(fā)酵進程中按照大、小菌不同的生理特征進行

19、分段調(diào)節(jié)pH值則會取得更好的發(fā)酵收率。通風量對菌系產(chǎn)酸的影響oooooo OOO8 7 6 5 4 3 2 12£一_<片一室0510152025303540發(fā)殍時間加通風量對菌系產(chǎn)酸分析圖中空白對照和調(diào)節(jié)溶氧量后的產(chǎn)酸轉(zhuǎn)變曲線能夠看出，在發(fā)酵到12h以前使其溶氧量控制在30%以下，有利于大菌快速生長。12h以后調(diào)高通氣量使溶氧量達到30%40%之間，使小菌大量繁衍，較大的通氣量能夠縮短小菌的延遲期，增進混合菌系的產(chǎn)酸，縮短發(fā)酵周期?？墒沁^大的通氣量，不僅造成生產(chǎn)上的浪費，而且嚴峻影響了大小菌代謝的協(xié)調(diào)性。這說明通風量的大小不僅影響大小菌之間的數(shù)量比例、生長狀態(tài)和產(chǎn)酸量，而且也

20、影響大小菌的生長周期。CaCO.濃度對菌系產(chǎn)酸的影響2 10 97 【1 7 6 3忘W豳姿0.010.020.030.Q40.050.060.07CaCOs濃度展圖中的曲線顯示，在發(fā)酵培育基中CaCO3濃度為時菌系產(chǎn)酸量最高，低于或高于該濃度時菌系產(chǎn)酸量都稍低，這是由于太低的CaCCh濃度無益于緩沖發(fā)酵液中的酸，造成酸的反饋抑制作用，而較高的CaCCh濃度乂會致使發(fā)酵液pH的轉(zhuǎn)變，降低菌系的代謝活力。4結(jié)論目前，在Vc二步混菌發(fā)酵合成2-KLG的工業(yè)化生產(chǎn)進程中，發(fā)酵培育基中適合的L-山梨糖起始濃度、碳酸鈣濃度、氮源、微量元素、起始pH值、通風量等能夠有效地調(diào)節(jié)2-KLG的產(chǎn)量，優(yōu)化菌系的生

21、理狀態(tài)。增進大小菌之間的協(xié)調(diào)，使其達到最佳發(fā)酵狀態(tài)。VC是我國自主知識產(chǎn)權(quán)開發(fā)的首批西藥之一，也是我國最主要的出口創(chuàng)匯原料藥之一。二步發(fā)酵法是我國VC生產(chǎn)的主要工藝方式，但是該法不能直接以葡萄糖為發(fā)酵原料，且涉及二步發(fā)酵三種菌，工序繁瑣。采用基因工程等先進技術(shù)，選育直接以葡萄糖為發(fā)酵原料的優(yōu)良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件將是我國VC生產(chǎn)技術(shù)研究的主要方向。另外，目前世界上很多國家正嘗試以真核生物為研究對象，利用它們合成VC的代謝途徑開發(fā)加倍環(huán)保的生物合成方式。從我國的二步發(fā)酵法推行后慢慢取代萊氏法這一進程能夠預測，隨著生物技術(shù)的不斷進展和更具優(yōu)勢的生物合成VC方式的不斷涌現(xiàn)，生物法必將完全取代化學法在VC生產(chǎn)中的地位，為了維持我國活著界VC生產(chǎn)上的優(yōu)勢地位，必需增強VC生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究工作。參考文獻1季輝煌，燕方龍，苗春等.新型絮凝劑用于維生素C發(fā)酵液預處置J.沈陽藥科大學學報，1997,14(2)：88-902陳雷，張銘錫.維生素C生產(chǎn)提取除蛋白工藝的改良J.黑龍江醫(yī)藥，2001,14(6):447-4483陳永林，劉梅