細胞RNA的提取及鑒定、RT-PCR檢測p53基因的表達

1、實驗報告實驗題目：細胞RNA的提取及鑒定、RT-PCR僉測p53基因的表達報告人：張銓合作者：殷悅涵實驗日期：一、實驗原理1 .細胞RNA的提取及鑒定細胞內(nèi)RNA通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白（RNR）的形式存在。分離、制備RNA時首先須破碎細胞，使RNP釋放到溶液中并與蛋白質(zhì)分離，然后將RNA同其他的細胞成分分離開并保證RNA的完整性。Trizol法分離提取的RNA產(chǎn)率高、純度好且不易降解，它是一種總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA由于RNase能迅速降解RNA,所以需創(chuàng)造一個無RNase的環(huán)境，在各個環(huán)節(jié)避免它的污染。評價RNA質(zhì)量的標準是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光

2、光度法測定RNA的濃度和純度，純RNA的A260/280=,實驗室條件下一般在之間，低于該值說明有蛋白污染，需要進一步抽提。2 .RT-PCR測p53基因的表達PCR是一種體外大量擴增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，利用已知序列作為引物，將兩引物之間的特定DNA片段進行復(fù)制，經(jīng)過多次循環(huán)是模板上特定DNA拷貝數(shù)呈指數(shù)級增長?；具^程為變性、退火、延伸三個步驟循環(huán)往復(fù)進行，每一輪過后特定的DNA片段的分子數(shù)增加一倍。RT-PCR等mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再經(jīng)PCR進行大量擴增，實質(zhì)上是對mRNA的擴增，常利用此技術(shù)克隆cDNA或分析某一特異基因在組織細胞中的表達情況。本實驗先以O(shè)ligo引物

3、來反轉(zhuǎn)錄合成細胞cDNA模板，然后采用p53特異性引物進行PCR擴增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳分析p53在兩種肺癌細胞（A549和H1299）中的表達水平。二、實驗材料及設(shè)備材料：肺癌細胞A549（野生型）和H1299（p53缺失型）、p53引物、GAPDH引物試劑：Trizol試劑、氯仿、異丙醇、無RNase水、乙醇、PromegaRT-PC威齊I盒、2*TaqPCRmix、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上樣緩沖液、DNA分子量標準、瓊脂糖耗材：Ep管、吸頭、一次性手套、口罩設(shè)備：5415R型冷凍離心機、NanoDrop2000超微量分光光度計、高壓消毒鍋、恒溫干燥箱、制冰機、

4、可調(diào)式取液器、PCRtZ、電泳儀、電泳槽、紫外檢測器、凝膠成像系統(tǒng)、冰箱三、實驗步驟1 .細胞RNA的提取及鑒定（一）RNA提取取1*106個細胞與管加氯仿?lián)u勻f4C,12000rpm離心15min分層取上層水相入新的Ep管中加入等體積異丙醇，搖勻，室溫靜置10min-4C,12000rpm離心10min,RNA沉淀一棄上清，力口1ml75%乙醇洗滌沉淀一4C,12000rpm離心5min一棄上清，晾干，用30仙l無RNase水溶解沉淀（二）RNA濃度和純度測定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度計測定260nm和280nm波長的OD值，并記錄Abs260/Abs280

5、比值及RNA濃度2 .RT-PC卷測p53基因的表達（一）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA預(yù)變性：取一支管加入樣品RNA2ng,以無水RNaseK補足體積至9l,70C,10min,立即置于冰上。每組做兩份模板不同的PCRK應(yīng)1.取兩只管，分別按下表加入試劑（20口體系，單位：pl）:試齊H1299組A549組2*TaqPCRmix1010p53上游引物11P53下游引物11無菌蒸儲水77H1299細胞cDNA模板1-A549細胞cDNA模板-12.設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)為:94c預(yù)變性5min94c變性30s58c退火30s72c延伸30s共30個循環(huán)72c延伸5min（三）RT-PC嚴物鑒定:1 .配2%&

6、#174;脂糖凝膠：瓊脂糖2g叮BE100ml微波加熱融化；冷卻至60c左右，加入GoldView（DNA染料）5口混勻，灌膠2 .電泳：向水平電泳槽中加入叮BE至恰好浸沒凝膠約1mm左右取15仙1RT-PC產(chǎn)物上樣,100V電泳2030min結(jié)果觀察：用凝膠成像儀觀察并拍攝電泳結(jié)果，以DNA分子量標準（marker）為參照，分析PCR產(chǎn)物大小及p53在兩種細胞中的表達情況。理論上，A549是p53野生型的細胞，正常表達p53,該樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，應(yīng)在390bp的位置出現(xiàn)擴增條帶；而H1299是p53缺失型的細胞，不表達p53,在相應(yīng)位置沒有擴增條帶。管家基因GAPDH作為實驗的內(nèi)部參

7、照，在兩種細胞中均有表達，電泳后在320bp處出現(xiàn)擴增條帶。四、實驗結(jié)果1 .細胞RNA的提取及鑒定提取到細胞RNA,用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測其Abs260/Abs280為,濃度為祖g/口。2 .RT-PC卷測p53基因的表達同排另T本第MAKER五、實驗討論1 .細胞RNA的提取及鑒定由于在RNA提取實當中，RNA濃度較高，為叱g/口，導(dǎo)致在取2仙g的RNA時，只需取仙l的RNA溶液，移液器的精度不高，容易造成誤差，因此應(yīng)將溶液稀釋至1卜g/左右再取2仙g的RNA溶液。Abs260/Abs280為，說明我們組提取的RNA較為純凈，提取步驟操作良好，幾乎沒有蛋白質(zhì)的污染，該溶液可以使用到RT-PCR的實驗中。2 .RT-PC卷測p53基因的表達可以看到我們組A549細胞中在390bp的位置出現(xiàn)擴增條帶，H1299在390bp處沒有出現(xiàn)擴增條帶，可說明A549細胞中正常表達p53