細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)復(fù)習(xí)資料(全)題庫(kù)

1、名詞解釋?zhuān)杭?xì)胞組織培養(yǎng)：細(xì)胞（組織）培養(yǎng)是指從生物體內(nèi)取出細(xì)胞（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。二倍體細(xì)胞株：具有二倍體染色體數(shù)的細(xì)胞株。細(xì)胞組織培養(yǎng)選材：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、觀察指標(biāo)確定所選組織器官。培養(yǎng)選材一般來(lái)自胚胎組織的培養(yǎng)物；比成體組織更易生存和生長(zhǎng)。這主要是因?yàn)榕咛ソM織有更多的胚胎組織干細(xì)胞，它們具有更高的自我更新和多能分化能力。原代培養(yǎng)：一般指從組織中分離在體外生長(zhǎng)至傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)。這種培養(yǎng)通常是異質(zhì)性，生長(zhǎng)緩慢，但比較能代表原組織的類(lèi)型并表達(dá)原組織特性。缺點(diǎn)是在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)失去許多原組織的細(xì)胞。傳代細(xì)胞：原代細(xì)胞

2、生長(zhǎng)物或細(xì)胞系生長(zhǎng)到一定階段，分散成單個(gè)細(xì)胞，按一定比例接種于新的培養(yǎng)容器內(nèi)稱(chēng)之傳代。傳代細(xì)胞稱(chēng)之細(xì)胞系，可分為兩類(lèi)：有限細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系。傳代形成的具有各自生物特性或標(biāo)志的細(xì)胞系稱(chēng)之為細(xì)胞株。世代：指細(xì)胞經(jīng)過(guò)一次分裂后完成后至下次分裂的過(guò)程。細(xì)胞富集：當(dāng)細(xì)胞分離純化并不完全徹底，培養(yǎng)物中能達(dá)到以某種細(xì)胞為主（占絕大多數(shù)）的程度。細(xì)胞純化：是指從原代培養(yǎng)前成分混雜的異質(zhì)性細(xì)胞懸液中或者從培養(yǎng)物中獲得單一類(lèi)型細(xì)胞的過(guò)程。通過(guò)細(xì)胞分離和純化得到細(xì)胞株或系。傳代：也稱(chēng)為再培養(yǎng)，把一瓶培養(yǎng)細(xì)胞全部或分成幾份再培養(yǎng)的過(guò)程。組織工程：組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原則及方法，在正確認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物的正常及

3、病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開(kāi)發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門(mén)新興學(xué)科。Densityinhibition:密度抑制，由于細(xì)胞密度過(guò)大，培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物過(guò)多和生存空間消失所引起細(xì)胞增殖的抑制現(xiàn)象。消化液：在原代細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞傳代時(shí)，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二鈉（EDTA），其次是一些特殊的組織細(xì)胞培養(yǎng)用的各型膠原酶。在原代細(xì)胞培養(yǎng)中，使用消化液從組織塊中分離（散）出單個(gè)的細(xì)胞；在進(jìn)行細(xì)胞傳代時(shí)，消化液使細(xì)胞脫離生長(zhǎng)表面并離散成單個(gè)細(xì)胞。平衡鹽溶液（BSS）：集緩沖能力、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營(yíng)

4、養(yǎng)供應(yīng)特點(diǎn)于一體，兼具維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液的酸堿度，同時(shí)供給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)離子成分的作用，常用的BSS有PBS、Hanks等。清潔液：是一種不含磨蝕性物質(zhì)，能迅速清除物品上污垢,分解臟污，令物品透明亮如的清潔用品。去分化：指已分化成熟的細(xì)胞和組織倒退分化，返回原始幼稚的狀態(tài)。但去分化并不意味著完全返回胚胎時(shí)期的原始細(xì)胞狀態(tài)，可重新表現(xiàn)出分化特點(diǎn)。接觸抑制：指細(xì)胞相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)（移動(dòng)）的現(xiàn)象。細(xì)胞融合：細(xì)胞融合是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(guò)膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程?？稍谧园l(fā)或人工誘導(dǎo)下發(fā)生。它可使兩個(gè)不同來(lái)源的細(xì)胞核在同一細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的功能，這樣的細(xì)胞稱(chēng)異核體，若異核體

5、出現(xiàn)有絲分裂時(shí)，則可使兩個(gè)不同來(lái)源的細(xì)胞核的染色體匯聚，形成合并有親本的大核，這樣的細(xì)胞稱(chēng)為雜種細(xì)胞或雜交細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無(wú)限增殖能力。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系具有長(zhǎng)期培養(yǎng)，倍增時(shí)間短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求較低的特點(diǎn)，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。Stemcell:干細(xì)胞，是指一類(lèi)具有自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞。雜交瘤技術(shù)：又稱(chēng)單克隆抗體制備技術(shù)。是指建立雜交瘤細(xì)胞系的技術(shù)，通常指B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，即將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合，以建立可以分泌單一性抗體的雜交瘤細(xì)胞系的技術(shù)。雜交瘤細(xì)胞：指腫瘤細(xì)胞與體細(xì)胞融合形成的雜交細(xì)胞，它

6、既保留了腫瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的能力，有具有參與融合的體細(xì)胞的一些特征?？寺。褐竿ㄟ^(guò)一定方法獲得由單個(gè)細(xì)胞無(wú)性繁殖形成的細(xì)胞集落。單克隆抗體（McAb）：B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下能增殖分化，轉(zhuǎn)變成產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞，若將單個(gè)產(chǎn)生特質(zhì)性抗體的B淋巴細(xì)胞分離出來(lái)，使之在體外分化增殖，產(chǎn)生一大群即一個(gè)克隆的細(xì)胞，這樣便可得到大量的、結(jié)構(gòu)相同的、均一的、針對(duì)抗原某一決定簇的抗體，這樣由一個(gè)克隆B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體又稱(chēng)為單克隆抗體。干細(xì)胞：干細(xì)胞是人體內(nèi)最原始的細(xì)胞，它具有較強(qiáng)的再生能力，在干細(xì)胞因子和多種白細(xì)胞介素的聯(lián)合作用下可擴(kuò)增出各類(lèi)的細(xì)胞。其生物學(xué)特性有：1.多能性2.自我更新能力3、高度增殖能力群體倍增

7、時(shí)間：細(xì)胞指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞群倍增所需的時(shí)間密度抑制（densityinhibition）：由于細(xì)胞密度過(guò)大，培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物過(guò)多和生存空間消失所引起細(xì)胞增殖的抑制現(xiàn)象生長(zhǎng)基質(zhì)：培養(yǎng)皿表面包被的這層能改善生長(zhǎng)表面的特性，促進(jìn)細(xì)胞粘附和貼壁的物質(zhì)。即生長(zhǎng)基質(zhì)問(wèn)答：1 簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞的主要生物學(xué)特點(diǎn)。答：體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)：（1）去分化：體外培養(yǎng),分化特征逐漸減弱，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能上的“可塑性”增大（2）貼壁鋪展：粘附于固相表面是錨定依賴(lài)性細(xì)胞生命活動(dòng)的基本要求。細(xì)胞被接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后首先要發(fā)生粘附，是細(xì)胞培養(yǎng)以后能否成功的第一步.提供什么樣的生長(zhǎng)表面是細(xì)胞能否成功粘附的主要因

8、素。鋪展是進(jìn)行生命活動(dòng)的一種基本的生長(zhǎng)特點(diǎn)或生長(zhǎng)行為鋪展?fàn)顩r制約細(xì)胞的分裂增殖活動(dòng)過(guò)程，細(xì)胞先由圓形變?yōu)閳A餅形（放射狀鋪展細(xì)胞）逐漸鋪開(kāi)伸展成為扁平的極性細(xì)胞。極性細(xì)胞就是各種有機(jī)體細(xì)胞是在體外的特征性細(xì)胞形態(tài)（3）接觸抑制和密度依賴(lài)性生長(zhǎng)抑制：細(xì)胞生長(zhǎng)有密度抑制，血清可降低密度抑制，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可降低密度抑制2 簡(jiǎn)述成體干細(xì)胞的定義與特點(diǎn)。答：成體干細(xì)胞是指存在于一種已經(jīng)分化組織中的未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類(lèi)型組織的細(xì)胞。成體干細(xì)胞存在于機(jī)體的各種組織器官中。成年個(gè)體組織中的成體干細(xì)胞在正常情況下大多處于休眠狀態(tài)，在病理狀態(tài)或在外因誘導(dǎo)下可以表現(xiàn)出不同程度的再生和更

9、新能力。包括造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞。成體干細(xì)胞有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）成體干細(xì)胞體積小，細(xì)胞器稀少，RNA含量較低，在增殖過(guò)程中處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，在組織結(jié)構(gòu)中位置相對(duì)固定。（2） 成體干細(xì)胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復(fù)及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。（3） 成體干細(xì)胞常處于一個(gè)有干細(xì)胞細(xì)胞基質(zhì)、對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化起調(diào)控作用的各種信號(hào)分子的特定微環(huán)境或稱(chēng)生物位中，取決于所在的微環(huán)境和自身的功能狀態(tài)。（4） 成干細(xì)胞沒(méi)有確定的來(lái)源。3 試比較天然和合成培養(yǎng)基的各自?xún)?yōu)缺點(diǎn)。答：1、天然培養(yǎng)基：最初的體外細(xì)胞培養(yǎng)，均采用天然培養(yǎng)基。其主要取自動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織中分離提取。天然培

10、養(yǎng)基（液）的種類(lèi)很多，包括生物性體液（如血清、血漿）、組織浸液（胚胎浸液）、水解乳蛋白等。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)豐富，培養(yǎng)效果良好；缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，來(lái)源受限，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，易發(fā)生支原體污染。2、合成培養(yǎng)基：研究者模擬、借鑒細(xì)胞在體內(nèi)生存生長(zhǎng)所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，設(shè)計(jì)出類(lèi)似體內(nèi)環(huán)境而適宜細(xì)胞在體外生存的各種培養(yǎng)基。優(yōu)點(diǎn)：（1）標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組成成分及含量明確便于精密地測(cè)定培養(yǎng)的細(xì)胞與培養(yǎng)液內(nèi)物質(zhì)變化的情況。（2）便于控制和調(diào)整實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并使培養(yǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)化。（3）合成培養(yǎng)液中沒(méi)有不透明物質(zhì)，使得培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)清晰透明，便于觀察記錄。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿(mǎn)足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。4

11、.簡(jiǎn)述細(xì)胞培養(yǎng)污染的種類(lèi)及污染的預(yù)防措施。答：細(xì)胞污染可分為以下三類(lèi)：物理性、化學(xué)性和生物性，物理污染：主要指溫度、放射線(xiàn)、振動(dòng)和輻射等。化學(xué)污染：主要指血清、培養(yǎng)液及試劑、水、培養(yǎng)用器皿和孵箱等。生物污染：主要指細(xì)菌、霉菌和酵母、支原體、病毒、細(xì)胞系交叉污染。預(yù)防的方法：1。從物品、用品消毒滅菌著手2。從操作者做起：（1）操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。（2）操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周?chē)鸁o(wú)菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口，要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持是鑰匙清

12、潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。3。早期留有充足的凍存儲(chǔ)備，可以復(fù)蘇早期凍存細(xì)胞使用。5 .試比較治療性克隆與體細(xì)胞重新編程。答：項(xiàng)目治療性克隆體細(xì)胞重新編程干細(xì)胞名稱(chēng)ES細(xì)胞細(xì)胞來(lái)源供者卵母細(xì)胞和患者體細(xì)胞技術(shù)路徑將體細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，形成克隆囊胚后，分離并建立ES細(xì)胞系優(yōu)勢(shì)ES細(xì)胞技術(shù)有較豐富的經(jīng)驗(yàn)積累，無(wú)外源性基因污染主要問(wèn)題卵母細(xì)胞去核技術(shù)待改進(jìn)；克隆胚胎形成效率過(guò)低；建立hES細(xì)胞系的效率低，且不穩(wěn)定；hES細(xì)胞不分化狀態(tài)和多潛能性的條件待優(yōu)化；誘導(dǎo)hES細(xì)胞體外定向分化成熟的方案尚不完善；移植治療存在成瘤性風(fēng)險(xiǎn)iPS細(xì)胞患者體細(xì)胞利用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將轉(zhuǎn)錄導(dǎo)入 到

13、體細(xì)胞核，篩選并建立iPS細(xì)胞系取材容易，操作方案相對(duì)簡(jiǎn)單，技 術(shù)體系較穩(wěn)定細(xì)胞核重編程的具體過(guò)程和導(dǎo)入的 轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)制不明；制備iPS 細(xì)胞的效率低；iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo) 定向分化的研究經(jīng)驗(yàn)較少；逆轉(zhuǎn)錄 病毒和慢病毒載體導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的 潛在風(fēng)險(xiǎn)；轉(zhuǎn)染基因可能給機(jī)體帶 來(lái)不利影響不存在倫理學(xué)爭(zhēng)議細(xì)胞替代治療理論上是最有希望的途徑具有潛在的應(yīng)用前景倫理問(wèn)題存在激烈的倫理學(xué)爭(zhēng)議其他可能用途制備疾病的新模型以研究發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和鑒定藥物治療反應(yīng)等6 .對(duì)新建細(xì)胞系或株的細(xì)胞確認(rèn)試驗(yàn)可采用哪些方法？列舉一種或以上方法并說(shuō)明其原理。答：新建細(xì)胞系或株、細(xì)胞庫(kù)（MCB和WCB）和生產(chǎn)終末細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行

14、鑒別試驗(yàn)，以確認(rèn)為本細(xì)胞，無(wú)其他細(xì)胞的交叉污染。細(xì)胞鑒別試驗(yàn)的方法有多種，包括細(xì)胞形態(tài)、生物化學(xué)法（如同工酶試驗(yàn)）、免疫學(xué)檢測(cè)（如HLA、種特異性抗血清）、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)（如染色體核型、標(biāo)記染色體檢測(cè)）、遺傳標(biāo)志檢測(cè)（如DNA指紋圖譜、STR圖譜、基因組二核苷重復(fù)序列）等。7 簡(jiǎn)述雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的三個(gè)技術(shù)關(guān)鍵。答：（1）.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：B淋巴細(xì)胞：接受抗原刺激后，能分泌針對(duì)該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡短命細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞：惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活長(zhǎng)命細(xì)胞。經(jīng)

15、篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞株沒(méi)有抗體分泌物。（ 2） .細(xì)胞融合技術(shù)：兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞可形成一個(gè)雜種細(xì)胞。基本過(guò)程包括細(xì)胞融合形成異核體、異核體通過(guò)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行核融合、最終形成單核的細(xì)胞稱(chēng)為雜種細(xì)胞或雜交細(xì)胞。常用方法有生物方法：如仙臺(tái)病毒化學(xué)方法：如聚乙二醇（PEG）物理方法：如電融合。（ 3） .雜交瘤細(xì)胞的篩選：人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程，可能產(chǎn)生多種類(lèi)型的細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。應(yīng)根據(jù)其細(xì)胞特性來(lái)選擇適當(dāng)?shù)暮Y選方法（如酶缺陷、藥物抗性標(biāo)記、營(yíng)養(yǎng)缺陷、溫度敏感等）。B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，TK+存活但短命骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT一或TK一死亡雜交瘤細(xì)胞

16、：HGPRT+，TK+存活由此可見(jiàn)，HAT選擇培養(yǎng)基及補(bǔ)救合成途徑酶缺乏的突變細(xì)胞株的建立，是細(xì)胞融合后選擇出雜交細(xì)胞株的關(guān)鍵因素。8簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)癌細(xì)胞的三個(gè)顯著基本特征。答：腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長(zhǎng)增殖、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的三個(gè)顯著基本特征：永生性、不受控增殖性、致瘤性。（1）永生性也稱(chēng)不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無(wú)限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系（株）都表現(xiàn)有這種性狀。永生性和惡性（包括浸潤(rùn)性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控。從一些具有永生性而無(wú)惡性的細(xì)胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等細(xì)胞可以證明。（2）

17、生長(zhǎng)增殖（不受控增殖性）：失去接觸抑制，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。失去錨著依賴(lài)性，可在瓊脂、甲基纖維素等支撐物上生長(zhǎng)。低血清要求，不依賴(lài)生長(zhǎng)因子，因其可自分泌產(chǎn)生促增殖因子。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克隆）的能力比正常細(xì)胞強(qiáng)。（3）致瘤性。細(xì)胞接種同種動(dòng)物或裸鼠后的致瘤性是客觀反映細(xì)胞惡性程度的指標(biāo)。9.細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途1. 藥物研究與開(kāi)發(fā)（1） 新藥篩選:如化學(xué)合成藥物藥效研究,中藥有效成分篩選與鑒定等.（2） 疫苗研究與開(kāi)發(fā):如病毒性疫苗的研究與開(kāi)發(fā)（肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等）,腫瘤疫苗（多肽疫苗）等.（3） 基因工程藥物研究與開(kāi)發(fā):如干擾

18、素研究與開(kāi)發(fā),細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究與開(kāi)發(fā)等.（4） 細(xì)胞工程藥物研究與開(kāi)發(fā):生物活性多肽研究與開(kāi)發(fā),人參皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究與開(kāi)發(fā).（5） 單克隆抗體制備:包括診斷用單克隆抗體,治療用單克隆抗體.基礎(chǔ)研究(1) 藥物作用機(jī)理(2) 基因功能(3) 疾病發(fā)生機(jī)理2,生物制藥(1) 疫苗生產(chǎn):如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等.(2) 基因工程藥物生產(chǎn):如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價(jià)值的一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子如干擾素,粒細(xì)胞生長(zhǎng)因子,胸腺肽等(3)診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)4 4)細(xì)胞工程藥物生產(chǎn):生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽,生物活性物質(zhì)等10 .細(xì)胞培養(yǎng)基本條件1,合

19、適的細(xì)胞培養(yǎng)基養(yǎng)基合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最重要的條件之一,培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì),而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境.2,優(yōu)質(zhì)血清目前,大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清.血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一,含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它營(yíng)養(yǎng)成分.3,無(wú)菌無(wú)毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件.在體外培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺乏對(duì)微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染,或者自身代謝物質(zhì)積累,可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡.因此,在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),必須保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒,及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物.4,恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)

20、溫度維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng),必須有恒定適宜的溫度.5,合適的氣體環(huán)境氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳.細(xì)胞培養(yǎng)基種類(lèi)與基本成分細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)很多,按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基),按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類(lèi).干粉培養(yǎng)基需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌,液體培養(yǎng)基由專(zhuān)業(yè)商家提供,用戶(hù)可直接使用,非常方便.每種細(xì)胞都有其合適的培養(yǎng)基,11 .細(xì)胞凍存與復(fù)蘇要點(diǎn)與注意事項(xiàng)1、細(xì)胞凍存要點(diǎn)(1)冷凍過(guò)程要緩慢.需要冷凍保存的細(xì)胞先在4冰箱中放置30-60分鐘;然后轉(zhuǎn)入-20,放置30分鐘;然后再轉(zhuǎn)入-80放置16-1

21、8小時(shí)(或過(guò)夜);最后放入液氮中長(zhǎng)期保存.有條件的地方,可用程控降溫儀,按每分鐘-1到-3速度降溫,一直到-80以下,然后直接放入液氮中長(zhǎng)期保存.(2)凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,活力大于90%,無(wú)微生物污染.(3)細(xì)胞濃度控制在：1M07-5M07/ml.(4)使用高濃度血清或蛋白保護(hù)劑.一般情況下,用于冷凍保存完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中血清濃度大于20%.(5)使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑,以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過(guò)程中免受冰晶破壞.目前,最常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜),使用終濃度為5-10%.但是,有些細(xì)胞系不能用DMSO作為冷凍保護(hù)劑,如人白血病細(xì)胞系HL-60.因?yàn)?DMSO能誘導(dǎo)HL-6

22、0細(xì)胞分化.在這種情況下,可選用其它冷凍保護(hù)劑,如甘油(glycele),羥乙基淀粉等.特別注意:(1)細(xì)胞在冷凍過(guò)程中在-20冰箱內(nèi)放置時(shí)間不可超過(guò)1小時(shí),以防止冰晶過(guò)大而破壞細(xì)胞.也可跳過(guò)-20這一步驟直接放入-80冰箱中,但這樣做細(xì)胞存活率要低一些.(2)DMSO稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量.因此,DMSO不能直接加到細(xì)胞液中,必須事先配制.(3)DMSO必須是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的.新買(mǎi)的DMSO本身處于無(wú)菌狀態(tài),第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管或瓶中,4保存.避免反復(fù)凍融造成DMSO裂解產(chǎn)生有害物質(zhì).并可減少污染機(jī)會(huì).如要過(guò)濾DMSO,必須選用耐DMSO的尼龍濾膜.細(xì)胞冷凍保存液主要成分:冷凍保

23、護(hù)劑,基礎(chǔ)培養(yǎng)液,血清或蛋白.常用細(xì)胞冷凍保存液:(1)10%DMSO+完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)(2)10%甘油+完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)懸浮細(xì)胞冷凍保存操作程序(液氮保存法):(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)物,離心200-400g5分鐘.用粘附(貼壁)細(xì)胞冷凍保存操作程序(液氮保存法):2、冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn):(1)快速解凍.凍存細(xì)胞從液氮中取出后,應(yīng)立即放入37水浴中,輕輕搖動(dòng)冷凍管,使其在1分鐘內(nèi)全部融化(不要超過(guò)3分鐘).(2)解凍操作過(guò)程動(dòng)作要輕.由于冷凍保存過(guò)的細(xì)胞變得非常脆弱,不僅解凍速度要快,而且動(dòng)作要輕.一般情況下,解凍后的細(xì)胞可

24、直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)(1ml凍存細(xì)胞液加入到25-30ml新鮮完全培養(yǎng)液中),24小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)替換舊培養(yǎng)液,以去除DMSO.如果,細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感,那么,解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑,然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中.特別注意:(1)解凍時(shí)務(wù)必注意安全,預(yù)防冷凍管爆裂.,要帶手套,用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出,放入37水浴中.切不可直接用手,以免凍傷.(2)冷凍管在水浴中解凍時(shí),液面不可超過(guò)凍存管蓋面,否則,易發(fā)生污染.解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法:(1)從液氮中取出凍存的細(xì)胞,立即放入37水浴中快速解凍.(2)將1-2ml凍存

25、細(xì)胞液加入到25ml新鮮完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中,輕輕混勻.(3)用80g離心2-3分鐘,棄上清液.(4)用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán),并計(jì)數(shù)細(xì)胞.(5)接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3M05/ml.12.細(xì)胞傳代要點(diǎn)與注意事項(xiàng)( 1) 代方法貼壁細(xì)胞(1)洗掉舊培養(yǎng)液；( 2) 、用無(wú)鈣鎂PBS洗滌細(xì)胞一至二次；( 3) 、加入適量Trypsin-EDTA溶液方法一：37或溫室作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓顆粒狀時(shí)，洗掉消化液，輕敲培養(yǎng)瓶邊緣使細(xì)胞自瓶壁脫落，然后加入適量的新鮮培養(yǎng)液，與脫落的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊混合均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，依正常條件繼續(xù)培養(yǎng)之。方法二：37或室溫作用數(shù)分鐘，待細(xì)胞自瓶壁脫落后，加入適量含血