課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

1、課題課題2 2土壤中分解尿素的細菌的土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)分離與計數(shù)1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一種重要的是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。農(nóng)業(yè)氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被農(nóng)作物被農(nóng)作物吸收。吸收。 土壤中的土壤中的細菌細菌將尿素將尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2、細菌能利用尿素的原因、細菌能利用尿素的原因 土壤中的細菌分解尿素是因為它們土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶能合成脲酶3、常見的分解尿素的微生物、常見的分解尿素的微生物 芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、 梭狀芽孢桿菌，

2、某些真菌和放線菌也能分解尿素。梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的、課題目的 從土壤中分離出從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌能夠分解尿素的細菌 統(tǒng)計統(tǒng)計每克土壤每克土壤樣品中究竟含有樣品中究竟含有多少這樣的細菌多少這樣的細菌課題背景課題背景CO（NH2）2 2NH3 CO2 H2O脲酶脲酶一、研究思路一、研究思路（一）篩選菌株（一）篩選菌株篩選菌株、統(tǒng)計菌落數(shù)目、設(shè)置對照篩選菌株、統(tǒng)計菌落數(shù)目、設(shè)置對照 （一）篩選菌株（一）篩選菌株 1、實例：、實例： PCR技術(shù)技術(shù)DNA多聚酶鏈式反應(yīng)多聚酶鏈式反應(yīng)是一種在是一種在體外體外將少量將少量DNA大量復(fù)制（大量復(fù)制（PCR）的技

3、的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫耐高溫（93 ）的）的DNA聚合酶。聚合酶。去哪里找？為什么？去哪里找？為什么？原因：原因：因為熱泉溫度因為熱泉溫度7080，淘汰了絕大多數(shù)微生物，淘汰了絕大多數(shù)微生物， 只有只有Taq細菌被篩選出來細菌被篩選出來。啟示：啟示：尋找尋找目的菌種目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求， 到到相應(yīng)的環(huán)境相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。中去尋找。熱泉熱泉 2、實驗室中微生物的篩選、實驗室中微生物的篩選（1）原理：）原理： 人為提供有利于人為提供有利于目的菌株目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、生長的條件（包括營養(yǎng)、 溫度、溫度、pH等），同時抑

4、制或阻止其他微生物生長。等），同時抑制或阻止其他微生物生長。（2）方法：）方法： 抑制大多數(shù)微生物的生長；抑制大多數(shù)微生物的生長； 促進促進目的菌株目的菌株的生長的生長（3）結(jié)果：）結(jié)果： 培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過 稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法等方法對它進行純化培養(yǎng)分離等方法對它進行純化培養(yǎng)分離。一、研究思路一、研究思路（一）篩選菌株（一）篩選菌株3、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：思考：思考：從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？ 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基在此培養(yǎng)基中哪

5、些作為碳源、氮源？在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？ 碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素從用途看此培養(yǎng)基屬于哪類？從用途看此培養(yǎng)基屬于哪類？ 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基允許允許特定種類特定種類的微生物生長，同時的微生物生長，同時抑制或阻抑制或阻止其他種類止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基。能篩選出哪類微生物？為什么（或如何進行篩選）？能篩選出哪類微生物？為什么（或如何進行篩選）？培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的氮源為尿素氮源為尿素，只有，只有能合成脲酶能合成脲酶的微生物才能分解的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶缺乏脲酶的微生物

6、由于不能分解尿素，的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制。缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制。所以用此培養(yǎng)基就所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物能夠選擇出分解尿素的微生物。KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g尿素尿素1.0g瓊脂瓊脂15.0g一、研究思路一、研究思路（一）篩選菌株（一）篩選菌株怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？一、研究思路一、研究思路（一）篩選菌株（一）篩選菌株以尿素為唯一以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)基是是分離分離尿素細

7、菌尿素細菌判斷該培養(yǎng)基判斷該培養(yǎng)基有無選擇性有無選擇性實驗組實驗組對照組對照組培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型是否接種是否接種目的目的結(jié)果結(jié)果只生長只生長尿素細菌尿素細菌生長生長多種微生物多種微生物是是組別組別（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目：（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目：想一想：你在必修想一想：你在必修3學習了哪種測定微生物數(shù)量的方法？學習了哪種測定微生物數(shù)量的方法？ 1、顯微鏡直接計數(shù)：、顯微鏡直接計數(shù)： 利用利用血球計數(shù)板血球計數(shù)板（血細胞計數(shù)板血細胞計數(shù)板），在，在顯微鏡顯微鏡下下 計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。 缺點：缺點：不能區(qū)分死菌與活菌不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運動細菌的

8、計數(shù)；不適于對運動細菌的計數(shù)； 需要相對高的細菌濃度；需要相對高的細菌濃度； 個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；一、研究思路一、研究思路（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目2、活菌計數(shù)法、活菌計數(shù)法稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法（1）原理：）原理：在在稀釋度足夠高稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的的一個菌落一個菌落是由是由一個細胞一個細胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一個菌落代表一個菌落代表原先的一個活細胞（活菌）原先的一個活細胞（活菌）。（2）公式：每克樣品中的菌落數(shù)（）公式：每克樣品中的菌落數(shù)（CV）M其中，其中，C代表某一

9、稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)， V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（mL） M代表稀釋倍數(shù)。代表稀釋倍數(shù)。一、研究思路一、研究思路（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目某同學在稀釋倍數(shù)為某同學在稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基中測得平板上菌落的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為平板時所用稀釋液的體積為0.1mL） （ ）A. 2.34108B. 2.34109C. 234D. 23.4 B練習練習公式：每克樣品中的菌落數(shù)（

10、公式：每克樣品中的菌落數(shù)（CV）M其中，其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)， V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（mL），）， M代表稀釋倍數(shù)。代表稀釋倍數(shù)。一、研究思路一、研究思路（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。在設(shè)計實驗時，一定在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少要涂布至少3個平板，作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力個平板，作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與準確性與準確性。在分析實驗結(jié)果時，。在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是

11、否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗重新實驗。注意事項注意事項為了保證結(jié)果準確，一般選擇為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在菌落數(shù)在30300的平的平板上進行計數(shù)。板上進行計數(shù)。為使結(jié)果接近真實值可將為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三同一稀釋度加到三個或三個以上的平板中個以上的平板中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低低。一、研究思路一、研究思路（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目（三）設(shè)置對照（三）設(shè)置對照主要目的是主要目的是排除實驗

12、組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度提高實驗結(jié)果的可信度。1、判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染：、判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染： 將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。2、判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：、判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用： 完全培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng)， 觀察菌落數(shù)目。觀察菌落數(shù)目。一、研究思路一、研究思路（三）設(shè)置對照（三）設(shè)置對照以尿素為唯一以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)基是是分離分解尿分離分解尿素的細菌素的細菌判斷該培

13、養(yǎng)基判斷該培養(yǎng)基有無選擇性有無選擇性實驗組實驗組對照組對照組培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型是否接種是否接種目的目的結(jié)果結(jié)果只生長分解只生長分解尿素的細菌尿素的細菌生長生長多種微生物多種微生物是是組別組別實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，實驗時，A同學從對應(yīng)的同學從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約大約150個個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約選擇出大約50個個菌落。分析其原因。菌落。分析其原因。原因分析：原因分析：（1）土樣不同）土樣不同（2）培養(yǎng)基污染或操作失誤

14、）培養(yǎng)基污染或操作失誤（或者是混入了其他的含氮物質(zhì)）（或者是混入了其他的含氮物質(zhì)）一、研究思路一、研究思路（三）設(shè)置對照（三）設(shè)置對照方案一：方案一：由其他同學由其他同學用與用與A同學相同土樣同學相同土樣進行實驗進行實驗結(jié)果預(yù)測：結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與如果結(jié)果與A同學一致，則證明同學一致，則證明A無誤；無誤；如果結(jié)果不同，則證明如果結(jié)果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。配制有問題。方案二：方案二：將將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)

15、基是否受到污染。小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。對照的設(shè)置是必不可少的。一、研究思路一、研究思路（三）設(shè)置對照（三）設(shè)置對照二、實驗設(shè)計二、實驗設(shè)計一土壤取樣一土壤取樣二樣品的稀釋二樣品的稀釋三微生物的培三微生物的培養(yǎng)與觀察養(yǎng)與觀察應(yīng)在火焰旁稱取土壤應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g10g。在稀釋土壤溶液的過在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火程中，每一步都要在火焰旁進行焰旁進行分離不同的微生物分離不同的微生物采用不同的稀釋度采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證

16、獲得菌落數(shù)在目的：保證獲得菌落數(shù)在3030300300之間、適于計數(shù)的平板之間、適于計數(shù)的平板測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？量，選用的稀釋范圍相同嗎？不同。不同。二樣品的稀釋二樣品的稀釋二、實驗設(shè)計二、實驗設(shè)計三微生物的培養(yǎng)與觀察三微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。 培養(yǎng)不同微生物往往需

17、要不同培養(yǎng)溫度培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細菌：細菌：3037培養(yǎng)培養(yǎng)12d 放線菌：放線菌：2528培養(yǎng)培養(yǎng)57d 霉菌：霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)34d。二、實驗設(shè)計二、實驗設(shè)計 一一 無菌操作無菌操作1 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。要滅菌。2 2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。旁操作。 二二 做好標記做

18、好標記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。 三三 制定計劃制定計劃三、操作提示三、操作提示以尿素為唯一以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)基是是分離分離尿素細菌尿素細菌判斷該培養(yǎng)基判斷該培養(yǎng)基有無選擇性有無選擇性實驗組實驗組對照組對照組培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型是否接種是否接種目的目的結(jié)果結(jié)果只生長只生長尿素細菌尿素細菌生長生長多種微生物多種微生物是是組別組別由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為

19、稀釋倍數(shù)為10103 310107 7。準備準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和和選擇培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要每個稀釋度下需要3 3個選擇培養(yǎng)基，個選擇培養(yǎng)基，1 1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。還需要個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。還需要8 8個滅菌試管個滅菌試管和和1 1個滅菌移液管個滅菌移液管 。將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯落數(shù)目應(yīng)明顯多于多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)

20、基是否起到了選擇選擇作用。作用。P251、通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏、通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2、 選擇每個平板上長有選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋倍計算個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與

21、評價P261、在以、在以尿素尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入入酚紅酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果果pH升高升高，指示劑將，指示劑將變紅變紅，說明該細，說明該細菌能夠分解尿素。菌能夠分解尿素。 2、測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水、測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍伊紅美藍 培養(yǎng)基培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)菌落呈現(xiàn)黑黑色色，通過記算得出水樣，通過記算得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。中大腸桿菌的數(shù)量。五、課題延伸五、課題延伸大腸桿菌呈黑色，中心有或

22、無金屬光澤大腸桿菌呈黑色，中心有或無金屬光澤大腸桿菌在大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂伊紅美藍瓊脂（EMBEMB）上典型特征）上典型特征 本課題知識小結(jié)本課題知識小結(jié): :1、使用選擇培養(yǎng)基的目的是（、使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A. .培養(yǎng)細菌培養(yǎng)細菌 B. .培養(yǎng)真菌培養(yǎng)真菌 C. .使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D. .表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2、能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是、能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是（ ） A. .CO2和和N2 B. .葡萄糖和葡萄糖和NH3 C. .CO2和尿素和尿素D. .葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素實踐訓練實踐訓練CD3、下列說法不正確的是（、下列說法不正確的是（ ）A. .科學