生物制藥工藝學(xué)習(xí)題第七章凝膠層析

1、第七章凝膠層析一、填空題1凝膠層析的分離原理有 、。這三種分離原理是互相補(bǔ)充的，在通常情況下起主導(dǎo)作用； 的作用隨流速增加而加強(qiáng)；只有在流速很高時(shí) 才起作用。2、瓊脂糖凝膠的一個(gè)特征是分離的分子量范圍非常大，其分離范圍隨著凝膠濃度上升而，顆粒強(qiáng)度隨濃度上升而 。3、凝膠粒度的大小對(duì)分離效果有直接的影響。一般來說，細(xì)粒凝膠柱流速低，洗脫峰窄，分辨率 ，多用于 等。粗粒凝膠柱流速高，洗脫峰平坦，分辨率 ，多用于等。4、 在作分級(jí)分離時(shí)，為了提高分辨率，多采用比樣品體積大 倍以上的柱體積，以上的柱比，較 吸液量、較 粒的凝膠固定相。5、溶質(zhì)通過色譜 柱時(shí)造成的峰加寬效應(yīng)包括 、6、葡聚糖凝膠的孔徑大

2、小取決于，其越小，凝膠孔徑越；而瓊脂糖凝膠的孔徑卻依賴于二、選擇題1凝膠層析中，有時(shí)溶質(zhì)的Kd>1，其原因是（）A. 凝膠排斥 B.凝膠吸附C.柱床過長(zhǎng)D.流速過低2、 凝膠層析中，有時(shí)小分子溶質(zhì)的Kd<1，其原因是（）A.水合作用 B.凝膠吸附C.柱床過長(zhǎng)D.流速過低3、 在凝膠層析中樣品各組分最先淋出的是（）A.分子量最大的B.體積最大的C.分子量最小的D.體積最小的 4、為了進(jìn)一步檢查凝膠柱的質(zhì)量，通常用一種大分子的有色物質(zhì)溶液過柱，常見的檢查物質(zhì)為藍(lán)色葡聚糖，下面不屬于它的作用的是A.觀察柱床有無溝流B.觀察色帶是否平整C.測(cè)量流速D.測(cè)量層析柱的外水體積5、在選用凝膠層析

3、柱時(shí)，為了提高分辨率，宜選用的層析柱是（）A.粗且長(zhǎng)的B. 粗且短的C. 細(xì)且長(zhǎng)的D. 細(xì)且短的三、名詞解釋1、全排阻：2、類分離：3、分級(jí)分離：4、柱比：5、操作壓：6、全滲入：7、分離度 Rs：四、問答題1、試述公式 Ve=V0+KdVi 各字母的物理意義。2、利用凝膠層析如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量？3、凝膠層析的應(yīng)用主要有哪些？并說明其原理。第七章 凝膠層析（答案）一、填空題1、凝膠層析的分離原理有平衡排除理論、擴(kuò)散分離理論、流動(dòng)分離理論。這三種分離原理 是互相補(bǔ)充的， 在通常情況下平衡排除理論起主導(dǎo)作用； 擴(kuò)散分離理論的作用隨流速增加而 加強(qiáng)；只有在流速很高時(shí)流動(dòng)分離理論才起作用。2、瓊脂

4、糖凝膠的一個(gè)特征是分離的分子量范圍非常大，其分離范圍隨著凝膠濃度上升而 下降 ，顆粒強(qiáng)度隨濃度上升而 提高 。3、凝膠粒度的大小對(duì)分離效果有直接的影響。一般來說，細(xì)粒凝膠柱流速低，洗脫峰窄， 分辨率 高 ，多用于 精制分離 等。 粗粒凝膠柱流速高， 洗脫峰平坦， 分辨率 低 ， 多用于脫鹽等。4、在作分級(jí)分離時(shí)，為了提高分辨率，多采用比樣品體積大25 倍以上的柱體積，25 以上的柱比，較 大 吸液量、較 細(xì) 粒的凝膠固定相。 5、溶質(zhì)通過色譜柱時(shí) 造成的峰加寬效應(yīng)包括 分子擴(kuò)散 、渦流擴(kuò)散 、 流動(dòng)相中傳質(zhì)阻力 、 固定相中傳質(zhì)阻 力。6、葡聚糖凝膠的孔徑大小取決于交聯(lián)度 ，其越小，凝膠孔徑

5、越 大 ；而瓊脂糖凝膠的孔徑卻依賴于 瓊脂糖濃度 。、選擇題1、凝膠層析中， 有時(shí)溶質(zhì)的 Kd>1 ，其原因是（B ）A.凝膠排斥B. 凝膠吸附C. 柱床過長(zhǎng)D. 流速過低2、凝膠層析中，有時(shí)小分子溶質(zhì)的Kd<1 ，其原因是（ A）A. 水合作用B. 凝膠吸附C. 柱床過長(zhǎng)D. 流速過低B）3、在凝膠層析中樣品各組分最先淋出的是A.分子量最大的B.體積最大的C.分子量最小的D.體積最小的4、為了進(jìn)一步檢查凝膠柱的質(zhì)量，通常用一種大分子的有色物質(zhì)溶液過柱，常見的檢查物質(zhì)為藍(lán)色葡聚糖， 下面不屬于它的作用的是（C）A.觀察柱床有無溝流B.觀察色帶是否平整C測(cè)量流速D.測(cè)量層析柱的外水體

6、積5、 在選用凝膠層析柱時(shí)， 為了提高分辨率， 宜選用的層析柱是（A）A.粗且長(zhǎng)的B.粗且短的C.細(xì)且長(zhǎng)的D.細(xì)且短的三、名詞解釋1、全排阻： 當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時(shí)， 較大的分子完全不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部， 只 能從顆粒間隙流過，稱“全排阻” 。其流經(jīng)體積最小，等于外水體積 V0 。2、類分離：將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離.選擇凝膠時(shí)，應(yīng)使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限， 而小分子組的分子量小于滲入限。 大分子的分 配系數(shù) Kd=0 ，小分子的 Kd=1 。3、分級(jí)分離：將分子量相差不大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，

7、分 級(jí)分離應(yīng)盡量使待分離各物質(zhì)的 Kd 值相差大些，并使分子量分布不在凝膠分離范圍的一側(cè)。4、 柱比：層析柱的長(zhǎng)度與直徑的比值一般稱作“柱比”。5、 操作壓：凝膠層析柱由于進(jìn)出口之間液位壓力差形成的對(duì)凝膠顆粒的壓力稱作“操作壓”。6、全滲入：被分離組分的分子量小于該種凝膠的滲入限，其分子可以自由進(jìn)出凝膠顆粒， 這叫做“全滲入” 。 其流經(jīng)體積最大，等于外水體積與內(nèi)水體積之和， V0 Vi 。7、分離度 Rs：式中Ve1、Ve2對(duì)應(yīng)于兩個(gè)峰的淋出體積；W1、W2和1、（T 2兩個(gè)峰寬度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。四、問答題1、試述公式 Ve=V0+KdVi 各字母的物理意義。答：公式 Ve=V0+KdVi 中

8、Ve 代表被分離組分的流經(jīng)體積， V0 代表外水體積， Vi 代表內(nèi)水 體積。 Kd 稱作“排阻系數(shù)” 或“分配系數(shù)”， 它反映了物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度。對(duì) 一定種類規(guī)格的凝膠，物質(zhì)的 Kd 值為該物質(zhì)的特征常數(shù)。排阻系數(shù)：當(dāng) Kd=1 時(shí)，洗脫體積 Ve=V0+Vi ，為全滲入。當(dāng) Kd=0 時(shí)，洗脫體積 Ve=V0 ，為全排阻。Ov Kd v 1時(shí)，洗脫體積 Ve=Vo+KdVi，為部分滲入。2、利用凝膠層析如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量？ 答：當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時(shí)， 較小的分子在柱中停留時(shí)間比大分 子停留的時(shí)間要長(zhǎng)， 于是樣品各組分即按分子大小順序而分開， 最先淋出的

9、是最大的分子 （2 分）。對(duì)于一個(gè)特定體系（凝膠柱） ，待測(cè)定物質(zhì)的洗脫體積與分子量的關(guān)系符合公式Ve=-KlogM +C先以 3 個(gè)以上（最好更多些）的已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白過柱，測(cè)取各自的Ve 值。以 Ve 作縱坐標(biāo)， logM 作橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（ 2 分）。在同一測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)取未知物質(zhì)的 Ve 值便 可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得分子量（ 2 分）。3、凝膠層析的應(yīng)用主要有哪些？并說明其原理。當(dāng)具有一定分子量分布的高聚物溶液從柱中通過時(shí)， 較小的分子在柱中停留時(shí)間比大分子停留的時(shí)間要長(zhǎng)，應(yīng)用：于是樣品各組分即按分子大小順序而分開， 最先淋出的是最大的分子 （2 分）。一、脫鹽：脫鹽用的凝膠多為大粒度的，高交聯(lián)度的凝膠。此時(shí)溶液中蛋白質(zhì)等大分子的 Kd=0 ，鹽類的 Kd=1 。由于交聯(lián)度大，凝膠顆粒的強(qiáng)度較好，加之凝膠粒度大，柱層操作比 較便利，流速也高。二、分子量測(cè)定：對(duì)于一個(gè)特定體系（凝膠柱） ，待測(cè)定物質(zhì)的洗脫體積與分子量的關(guān)系符 合公式Ve=-K