溶液各種配制

1、附錄：常用試劑配制及應(yīng)用一、常用緩沖液、試劑的配制碳酸鹽緩沖液(Carbonate-Bicarbonate Buffer)由于碳酸鹽pH值偏堿，因此，常用于pH>9的緩沖液配制（附表1）。附表1. 0.2 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.210.7）pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3 (ml)9.24.046.010.027.522.59.37.542.510.130.020.09.49.540.510.233.017.09.513.037.010.335.514.59

2、.616.034.010.438.511.59.719.530.510.540.59.59.822.028.010.642.57.59.925.025.010.745.05.0磷酸緩沖液(Phosphate Buffers，PB) 磷酸鹽是使用最廣泛的一種緩沖劑，由于它們是二級(jí)解離，有二個(gè)pKa 值，所以用它們配制的緩沖液，pH 范圍最寬。NaH2PO4：pKa12.12，pKa27.21； Na2HPO4：pKa17.21，pKa212.32。另外，磷酸鹽還有鉀鹽分子形式，一般來說，低溫時(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，因此，配制細(xì)胞培養(yǎng)用試劑時(shí)常常添加鉀鹽試劑，但若配制十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯

3、酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用鈉鹽而不能用鉀鹽，因?yàn)镾DS會(huì)與磷酸鉀生成難溶的十二烷基硫酸鉀。磷酸緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：可配制成不同離子強(qiáng)度的緩沖液；適用pH緩沖范圍較寬；受溫度影響緩沖液pH值變化較小；離子強(qiáng)度對(duì)緩沖液pH影響較小，如0.1mol/L緩沖液稀釋10倍其pH變化小于0.1。磷酸緩沖液的缺點(diǎn)是：磷酸鹽易與鈣離子（Ca2+）、鎂離子（Mg2+）及重金屬離子結(jié)合生成不溶的沉淀物；可能干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如對(duì)某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。NaH2PO4的pH值偏酸性，可用作pH<4的緩沖液。Na2HPO4的pH值偏堿性，可用作pH>10的緩沖液。而pH68的中性緩

4、沖液是更常用的緩沖液，需要NaH2PO4與Na2HPO4兩種磷酸鹽混合配制（附表2）。附表2. 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH5.78.2）pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2H PO4 (ml)5.793.56.57.039.061.05.892.08.07.133.067.05.990.010.07.228.072.06.087.712.37.323.077.06.185.015.07.419.081.06.281.518.57.516.084.06.377.522

5、.57.613.087.06.473.526.57.710.589.56.568.531.57.88.591.56.662.537.57.97.093.06.756.543.58.05.394.76.851.049.08.14.295.86.945.055.08.23.097.0磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate-buffered saline, PBS)磷酸鹽緩沖液是在磷酸緩沖液基礎(chǔ)上添加NaCl以維持溶液的滲透壓，因此，PBS適用于做細(xì)胞緩沖液，常用PBS配制如下。NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g在800ml蒸餾水中溶解，用HCl調(diào)節(jié)溶液的p

6、H值至7.27.4加水定容至1L，15psi（1.05kg/cm2）高壓滅菌20min，室溫保存?zhèn)溆?。Tris緩沖液（Tris-HCl Buffer, TB）Tris的pH值偏于堿性，因此，通過添加HCl調(diào)節(jié)pH至所需值，Tris-HCl緩沖液的離子強(qiáng)度（mol/L）是專指Tris的濃度，如某一特定pH的0.05 mol/L Tris緩沖液的配制是將50ml 0.1 mol/L Tris堿溶液與附表3所示相應(yīng)體積（ml）的0.1 mol/L HCl混合，加水至將體積100ml，即為0.05 mol/L Tris緩沖液。另外，按附表3制備的緩沖液，由于試劑來源的不同，緩沖液pH可能與所需略有差異

7、，此時(shí)可通過稍許減少或增加HCl用量，精細(xì)調(diào)節(jié)pH至所需值。附表4. 0.05 mol/L Tris緩沖液pH需0.1 mol/L HCl（ml)pH需0.1 mol/L HCl（ml)7.145.78.126.27.244.78.222.97.343.48.319.17.442.08.417.27.540.38.514.77.638.58.612.47.736.68.710.37.834.58.88.57.932.08.97.08.029.2Tris鹽緩沖液（TBS）：Tris鹽緩沖液是在Tris緩沖液基礎(chǔ)上添加NaCl以維持溶液的滲透壓，因此，TBS也適用于做細(xì)胞緩沖液，常用TBS配制如下

8、。8g NaCl、0.2g KCl以及3g Tris溶解于800ml蒸餾水中，加入0.015g酚紅并用HCl調(diào)pH至7.4用蒸餾水定容至1L，分裝后在15psi（1.05kg/cm2）高壓滅菌20min，室溫保存。現(xiàn)在常用Tris鹽緩沖液通常不加pH指示劑，而且該溶液如果不用于細(xì)胞培養(yǎng)，通常不加KCl及酚紅。Hanks液 (Hanks Balanced Salt Solution)Hanks液是一種平衡鹽溶液，主要用于細(xì)胞培養(yǎng)取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗等。貯存液A液：(I)NaCl 80g KCl 4g MgSO4·7H2O 1gMgCl2·6H2O 1g用雙蒸餾水定容

9、至450ml。(II)CaCl2 1.4g (或CaCl2·2H2O 1.85g)用雙蒸餾水定容至50ml。將I和II液混合，即成A液。貯存液B液：Na2HPO4·12H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g, 酚紅 0.2g, 葡萄糖 10.0g, 酚紅應(yīng)先置研缽內(nèi)磨細(xì)，然后按配方順序一一溶解，用雙蒸餾水定容至500ml。 (3)應(yīng)用液：A、B儲(chǔ)存液分別經(jīng)112.6濕熱滅菌20min，取A和B液各25ml，加無菌雙蒸餾水至450ml，使用前用無菌的3.5%或5.6% NaHCO3調(diào)至所需pH。注意：藥品必須全部用A.R試劑，并按配方順序加入，用適量雙蒸水溶解，待前一種藥

10、品完全溶解后再加入后一種藥品，最后補(bǔ)足水到總量。無Ca2+、Mg2+ Hanks液（Hanks Solution without calcium, magnesium sulfate）NaCl 80g, KCl 4g, Na2HPO4·12H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g,葡萄糖 10g,用雙蒸餾水溶解后，加入0.4酚紅溶液50ml，再加入雙蒸水至1000ml，112.6濕熱滅菌20min，4 冰箱保存。臨用前將原液用無菌雙蒸水作1：10倍稀釋，用無菌的3.5%或5.6% NaHCO3調(diào)至所需pH。pH7.2檸檬酸鹽緩沖液(Citrate Buffer)檸檬酸 0.327g

11、檸檬酸鈉 2.63g磷酸氫鈉 0.222葡萄糖 0.00255mg蒸餾水加至100ml。pH3.3枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液（Citric acid- Phosphate Buffer) 0.131mol/L citrate acid，0.066mol/L Na2HPO4，等量混合，調(diào)節(jié)pH至3.3。0.5 mol/L EDTA, pH 8.0EDTA·2H2O 186.1 gNaOH 20 g將EDTA·2H2O加入800ml水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌。用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，EDTA直到接近pH 8.0才完全溶解，定容至1L。分裝后高壓蒸汽滅菌。0.4%酚紅溶液取酚紅0

12、.4g置于研缽中逐滴加入1mol/L NaOH溶液11.28ml，邊研磨邊使酚紅轉(zhuǎn)變?yōu)殁c鹽溶于水中，加雙蒸水至100ml，過濾后，4 冰箱保存。醋酸鉀（Potassium Acetate） 在60ml 5mol/L醋酸鉀溶液中，加入11.5ml冰醋酸和28.5ml水。該溶液用于堿性裂解。3mol/L 醋酸鈉（Sodium Acetate），pH5.2和pH7.0 在800ml水中溶解408.1g三水醋酸鈉，用冰乙酸調(diào)pH至5.2或用稀釋乙酸調(diào)pH至7.0，加雙蒸水至1L。分裝后高壓滅菌。檸檬酸鈉緩沖液(Sodium Citrate Buffer) 檸檬酸鈉 1.8g HCl(1mol) 4ml

13、 無水乙醇 95ml 先用100ml去離子水溶解檸檬酸鈉，然后加入HCl和無水乙醇，再補(bǔ)充去離子水至總量200ml。飽合硫酸銨溶液(Saturated Ammonium Sulfate Solution) 取500ml雙蒸餾水，加入約400克硫酸銨，水浴加熱至70，磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?，直到加入的硫酸銨不再溶解，以氨水（也可用NaOH）調(diào)pH7.2，室溫保存。二、酶免疫檢測(cè)常用試劑配制包被液(Coating Buffer)（pH9.5碳酸鹽緩沖液）Na2CO3·10H2O 8.58g NaHCO3 5.8g 溶于雙蒸水至1000ml。封閉液(Confining liquid)（5%脫脂

14、乳-PBS溶液，pH7.4）脫脂乳 50g加0.02mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）至1000ml溶解。洗液(washing liquid) 氯化鈉 8.0g 磷酸二氫鉀 0.2g 磷酸氫二鈉（12H2O） 2.9g 吐溫-20 0.5ml 加去離子水至1000ml溶解即可。終止液(stop buffer)（2mol/L H2SO4）： 21.7ml H2SO4 加去離子水至200ml。緩沖甘油(glycerine buffer) 甘油 9份 PB（pH8.0） 1份 將9份甘油與1份PB合并，充分混勻。0.5%H2O2-甲醇液(Hydrogen Peroxide-Methanol

15、 Solution)（總體積120ml） 3%H2O2 20ml 甲醇 100mlDAB-H2O2底物緩沖液(DAB- H2O2 Substrate Buffer)取6mg二氨基聯(lián)苯胺(3,3-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride DAB)溶解于10ml 0.05mol Tris-HCl pH7.6。使用前取0.3%H2O2 0.1ml加入到DAB溶液中(H2O2的終濃度為0.003%)。如有沉淀生成，則用濾紙過濾。5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/四唑氮藍(lán)底物顯色液（BCIP/NBT Substrate Solution）貯存液配制：NBT：在10ml 70%的乙

16、醇中溶解0.5g NBT。BCIP：在10ml 100%二甲基甲酰胺中溶解0.5g BCIP。貯存液4保存，可穩(wěn)定一年。底物顯色液：取66l NBT貯液與33l BCIP加入到10ml堿性磷酸酶緩沖液中，充分混勻，底物顯色液應(yīng)在用前1小時(shí)內(nèi)配制。三、細(xì)胞相關(guān)試劑配制 L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutamin Solution）（0.2 mol/L）稱2.9 g L-谷氨酰胺（分子量為146.15）用去離子水溶解至100 ml，過濾除菌，分裝小瓶，45 ml/瓶，-20凍存。100x青-鏈霉素（雙抗）溶液（P/S Penicillin/Streptomycin Solution）取青霉素

17、G（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1 g，溶于100 ml去離子水中，分裝小瓶，45 ml/瓶，-20凍存。7.5% NaHCO3溶液（NaHCO3 Solution）稱分析純NaHCO3 7.5 g，用去離子水溶解至l00ml，過濾除菌，分裝小瓶，45 m1/瓶，蓋緊瓶塞，4保存。HEPES溶液（HEPES Solution）（1mol/L）稱23.83 g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基呱嗪-N'-2-乙基磺酸，分子量為238.3），用去離子水溶解至100 ml，過濾除

18、菌，分裝小瓶，45 m1/瓶，4保存。氨基喋呤（A）貯存液（Aminopterin Stocking Solution）（100×, 4×10-5 mol/L）稱1.76 mg氨基喋呤（Aminopterin, 分子量440.4），溶于90 m1去離子水中，滴加l mol/L NaOH 0.5 m1，并不斷攪動(dòng)，待氨基喋呤完全溶解后，加1 mol/L的HCl 0.5m1中和，再補(bǔ)加去離子水至100 m1。過濾除菌，分裝小瓶，2 ml/瓶，-20凍存。次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷貯存液（HT Stocking Solution）（100×,H: 10-2 mol/L; T

19、: 1.6×10-3 mol/L）稱取136.l mg次黃嘌呤（Hypoxanthine，分子量136.1）和38.8 mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，分子量242.2），加去離子水至l00 ml，置4550水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶，2 m1/瓶，-20凍存。用前可置37加溫助溶。HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)液98 ml，A貯存液1 m1，HT貯存液l ml。秋水仙素溶液（colchicine Solution）稱取10 mg秋水仙素，溶于100 m1生理鹽水中（即為100 g/ml），過濾除菌后，分裝小瓶，20凍存?zhèn)溆谩lsevers血細(xì)胞保存液（Alsevers Solu

20、tion）葡萄糖 2.05g, 檸橡酸鈉 0.8g, NaCl 0.42g，蒸餾水 l00ml。以上成分混勻后，微加溫使其溶解后，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 6.1，分裝于三角瓶中(3050ml/瓶), 113濕熱滅菌15min，4保存?zhèn)溆?。?xì)胞凍存液(Freezing Medium)50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。0.025%胰蛋白酶0.2%EDTA細(xì)胞消化液(Trypsin-EDTA Solution) A: 2.5%胰蛋白酶: 胰蛋白酶 2.5g 磷酸緩沖鹽溶液 100ml 過濾除菌保存。 B: 0.2%二乙胺四乙酸二鈉（EDTA） EDTA 0.2g 雙蒸餾水

21、100ml 高壓滅菌保存。 取A液1份，加B液99份，混勻，分裝-20保存。0.83% NH4CI溶液(Ammonium Chloride Solution)NH4CI 0.83gKHCO3 0.1gEDTA·2Na 0.0037g 蒸餾水加至100ml。Tris-NH4Cl溶液(Tris-Ammonium Chloride Solution) NH4Cl 3.735g/450ml雙蒸水+Tris 1.3g/50ml雙蒸水（pH 7.65）。細(xì)胞裂解液（Cell Lysis Solution）20mmol/L HEPES(pH 7.5)150mmol/L NaCl1 mmol/L E

22、DTA10mg/ml leupeptin1mmol/L PMSF1% Triton X-1000.5% deoxicholate (sodium salt)0.1% SDS組織勻漿緩沖液（Histolysis Buffer）50mmol/L Tris-HCl (pH7.5)150mmol/L NaCl 1% NP401mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride 4mg/ml leupeptin1mg/ml aprotinin細(xì)胞核裂解液(Nuclear Lysis Buffer)10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)150mmol/L NaCl10mm

23、ol/L EDTA蛋白酶K 100µg/ml0.4%SDS（最后加）10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF） 在異丙醇中溶解PMSF至1.74mg/ml，即10mmol/L，分裝后保存于-20，如果需要的話，可將儲(chǔ)存液制備至17.4mg/ml，即100mmol/L的高濃度。閃爍液(Scintillation Solution) PPO (2,5-二苯基) 5.0g、POPOP（1,4-雙5苯基）0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可將POPOP加入二甲苯，在37水浴上溶解后，再加PPO，然后補(bǔ)足二甲苯。3H-TdR 工作液（woking Solution） 按1:20的比例將濃度為1

24、mCi/ml的3HTdR用無血清的RPMI培養(yǎng)液稀釋，終濃度為50µCi/ml。肝素溶液的配制： 含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為4 。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。 型膠原酶： 0.1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)樾湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20保存。 用時(shí)提前一小時(shí)37復(fù)溫即可.

25、 0.1%的I型膠原酶的配置，100mg的粉末狀的I型膠原酶可以溶于100ml的DMEM/F12，0.22微米濾器過濾0.1%的I型膠原酶的配置，100mg的粉末狀的I型膠原酶可以溶于100ml的DMEM/F12，0.22微米濾器過濾.四、染色液配制（Prepration of Staining Solution）蘇木素液(Hematoxylin Solution)：蘇木素2.5g，乙醇25.0ml，鉀明礬2.5g，氧化汞1.25g，冰乙酸20.0ml，蒸餾水500.0ml。配制方法是先將蘇木素溶于乙醇中（稍加熱）。將預(yù)先已溶解明礬的蒸餾水加入蘇木素乙醇液中，使溶液盡快沸騰后，將火焰熄滅，慢慢

26、加入氧化汞，防止溶液油濺出，再煮沸2min。將燒瓶立即浸入冷水中，當(dāng)染液冷卻后，加入醋酸，室溫保存，用前過濾。伊紅Y染色液(Eosin Y Solution)伊紅Y 0.51.0g，蒸餾水75ml，95%乙醇25ml，冰乙酸12滴。先取少許蒸餾水加入伊紅，用玻棒將伊紅研碎，再加入全部蒸餾水，溶解后加入乙醇。甲基綠染色液(Methyl Greeen Solution)新購買的甲基綠需用氯仿處理去除甲基紫。方法是將2%甲基綠水溶液20ml傾入潔凈分液漏斗，移去慢慢下沉帶紫紅色的氯仿，再加入新的氯仿10ml，如此反復(fù)更換氯仿，到無紫紅色為止。該液作為貯存液，4保存。染色液：甲基綠貯存液5ml，5%派

27、諾寧水溶液1ml，蒸餾水12ml，0.2mol/L乙酸鈉(pH4.8)18ml（臨用前配制，濾紙過濾）。吖啶橙貯存液(Acridine Orange Stocking Solution) 10mg吖啶橙溶解于100ml PBS中，pH4.86.0濾過，4避光保存。吉姆薩貯存液(Giemsa Solution)吉姆薩染色粉1g先溶于少量甘油，在研缽內(nèi)研磨30min以上，至看不見顆粒為止，再將全部(66ml)剩余甘油倒入，于56溫箱內(nèi)保溫2h。然后再加入甲醇(66ml)，攪勻后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可長(zhǎng)期保存，一般剛配制的母液染色效果欠佳，保存時(shí)間越長(zhǎng)越好。臨用時(shí)用pH7.4磷酸緩沖液

28、稀釋10倍，隨配隨用。瑞氏染色液(Wrights Solution)瑞氏染色粉 0.3g甘油 3ml甲醇 97ml將瑞氏染色粉放干燥研缽內(nèi)磨細(xì)，加入甘油繼續(xù)研磨，不斷滴加甲醇并繼續(xù)研磨，將上層溶解的染料倒入棕色瓶中，直至染料全溶后加甲醇至所需量。混勻后置棕色瓶中保存，用前過濾。一般配制后置室溫一周便可使用，保存時(shí)間愈入，則染色效果愈佳。吉姆薩-瑞氏染色液(Giemsa- Wrights Staining Solution)瑞氏染色粉0.3g吉姆薩染色粉 0.03g甲醇 100ml將二種粉末置于研缽中磨細(xì)，再逐滴加入甲醇混勻后倒入棕色瓶中，塞緊瓶口并充分振蕩。置室溫溶解后使用。噻唑蘭（MTT）

29、稱取250mgMTT，加50ml PBS（0.01mol/L，pH 7.4）在磁力攪拌器上攪拌30min，用0.22mm的微孔濾膜過濾除菌，分裝，4保存。兩周內(nèi)有效。臺(tái)酚藍(lán)染色液(Trypan Blue Solution)A：臺(tái)酚藍(lán)染料 1g蒸餾水 100ml將染料置于研缽中邊研磨邊加入蒸餾水溶解。B：NaCl 1.7g蒸餾水 100ml臨用前A、B液1：1混合，離心沉淀，取上清供染色用?；旌虾蟮娜疽捍娣胚^久，易形成沉淀，故應(yīng)新鮮配制。染色時(shí)，取細(xì)胞懸液0.1ml加入新鮮配制的染色液一滴，室溫下染510分鐘，取一滴懸液于載波片上，加蓋玻片，高倍鏡下檢查。死亡細(xì)胞膨大并染成淺藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，

30、大小正常。五、固定劑(Fixatives)大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質(zhì)為水溶性，在用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，常需固定。但肽類和蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)不同，因而對(duì)不同的固定方法或固定劑的反應(yīng)也不同。某些固定劑甚至可同時(shí)破壞和/或保護(hù)同一抗原的不同抗原決定簇。因此，在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，很有必要了解所要研究的物質(zhì)（蛋白質(zhì)或肽類）的化學(xué)性質(zhì)，并根據(jù)需要來選擇適宜的固定劑（或固定方法）以及改進(jìn)固定條件。目前，免疫細(xì)胞化學(xué)研究中常用的固定劑仍為醛類固定劑，其中以甲醛類和戊二醛最為常用。4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液, pH7.3（formaldehyde-Phasphate Buffer）

31、多聚甲醛 40g 0.1mol/L磷酸緩沖液至1000ml 配制方法：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer以下簡(jiǎn)稱PB），加熱至60左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）至完全溶解，通常需滴加少許1N NaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混勻。該固定劑較適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，最好是動(dòng)物經(jīng)灌注固定取材后，繼續(xù)浸泡固定224h。另外，該固定劑較為溫和，適于組織標(biāo)本的較長(zhǎng)期保存。4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉（formaldehyde-Sodium Phosphate/Sodium

32、Hydroxide Buffer） A液：多聚甲醛 40g 蒸餾水400ml B液：Na2HPO4·2H2O 16.88g 蒸餾水 300ml C液：NaOH 3.86g 蒸餾水 200ml配制方法：A液最好在500ml的三角燒瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。注意，在溶解多聚甲醛時(shí)，要盡量避免吸入氣體或?yàn)R入眼內(nèi)。B液和C液配制好后，將B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl 將pH調(diào)至7.27.4，最后，補(bǔ)充雙蒸水至1000ml充分混合，4冰箱保存?zhèn)溆?。該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，用于免疫電鏡時(shí)，最好加入少量新鮮配制的戊二醛，使

33、其終濃度為0.5%1%。該固定劑較溫和，適于組織的長(zhǎng)期保存。組織標(biāo)本于該固定液中，4冰箱保存數(shù)月仍可獲得滿意的染色效果。六、蛋白電泳相關(guān)試劑30丙烯酰胺（Acrylmide） 丙烯酰胺 29g N, N-亞甲雙丙烯酰胺 1g 溶于60ml水中，加熱至37溶解，補(bǔ)加水至終體積100ml。0.45µM濾器過濾除雜質(zhì)，置深色瓶中室溫保存。考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（Coomassie Staining Solution） 1. 稱取1 g考馬斯亮藍(lán)R-250，置于1 L燒杯中。 2. 量取250 ml的異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解。 3. 加入100 ml的冰醋酸，攪拌均勻。 4. 加入

34、650 ml的去離子水，攪拌均勻。 5. 用濾紙除去顆粒物質(zhì)后，室溫保存。考馬斯亮藍(lán)脫色液（Destaining Solution） 量取下列溶液，置于1 L燒杯中，充分混合后使用。 醋酸 100ml乙醇 50mldH2O 850ml 1mol/L二硫蘇糖醇貯存液（DTT Stocking Solution）用20ml 0.01mol/L 乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，過濾除菌后分裝成1ml小份貯存于20保存。DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。0.1mol/L pH 2.4甘氨酸-HCl緩沖液(Glycine-HCl Buffer)稱取固體甘氨酸 (MW 75.07)1

35、5.01克，用蒸餾水溶解后，加入0.2mol/L HCl 648ml，然后定容成2000ml。2×SDS凝膠加樣緩沖液(2×Loading Buffer)100 mmol/L Tris.Cl（pH6.8）200 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）4%SDS（電泳級(jí)）0.2% 溴酚藍(lán)20% 甘油不含二硫蘇糖醇的2×SDS凝膠加樣緩沖液可以保存于室溫，臨用前須從1mol/L二硫蘇糖醇（DTT）貯存液現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液。10%十二烷基硫酸鈉（SDS）在900ml蒸餾水中溶解100g電泳級(jí)SDS,加熱至68助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝

36、備用。SDS的微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，因此稱量時(shí)要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的SDS,10%SDS溶液無需滅菌。電轉(zhuǎn)印緩沖液為(Semi-Dry Transfer Buffer)Tris 3gGlycine 14.4gSDS 0.185g 加入甲醇200ml，用去離子水調(diào)至1000ml。Tris-乙酸50×（TAE）Tris 堿 242g 冰乙酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 100ml 蒸餾水定容至1L。Tris-硼酸5×（TBE）Tris 堿 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20ml 蒸餾水定

37、容至1L。TE緩沖液 10×(pH7.4, 7.6, 8.0) 1. 量取下列溶液，置于1 L燒杯中。1mol/L Tris-HCl(pH7.4, 7.6, 8.0) 100ml500mmol/L EDTA(pH8.0) 20ml2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，均勻混合。3. 將溶液定容至1 L后，高溫高壓滅菌。4. 室溫保存。Tris甘氨酸緩沖液（Tris-Glycine Buffer 5×） Tris 15.1g 甘氨酸（電泳級(jí)） 94g 10SDS（電泳級(jí)） 50ml 蒸餾水定容至1L。七、淋巴細(xì)胞分離液聚蔗糖泛影葡胺分層液(Ficoll-paque Gr

38、adient Mixer)90g/L聚蔗糖15ml，加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.14)。 90g/L聚蔗糖17.5ml，加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.13)。 90g/L聚蔗糖20ml，加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.12)。 90g/L聚蔗糖24ml，加500g/L泛影葡胺10ml(比重1.08)。Percoll配制 (Prepration of Percoll)將一份10×PBS與9份Percoll貯存液混合，制成等滲Percoll懸液，此懸液被認(rèn)為是100%Percoll，其密度為1.1294/ml。利用1×PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋100%

39、 Percoll，可獲得適宜密度的細(xì)胞分層液，用于各種細(xì)胞的分離，其濃度與密度的關(guān)系如下： 70% Percoll 比重1.090g/ml 60% Percoll 比重1.077g/ml 50% Percoll 比重1.067g/ml 40% Percoll 比重1.056g/ml 30% Percoll 比重1.043g/ml20% Percoll 比重1.037g/ml人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離Ficoll分層液配制9聚蔗糖（Ficoll）24份34泛影葡胺（Urografin） 10混合，測(cè)比重為1.0771.078，G5玻璃濾器過濾除菌。4冰箱保存?zhèn)溆?。八、其它試劑佐?Adj

40、uvant)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用弗氏佐劑（Freund adjuvant），其成分通常是羊毛脂1份、液體石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：29（V/V），充分混合后即是不完全福氏佐劑，如果在每毫升不完全佐劑加入120mg卡介苗就成為完全弗氏佐劑。配制方法：將羊毛脂與石蠟油按比例置于容器內(nèi)，超聲波混勻，高壓滅菌， 4保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗34mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上510min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用

41、一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。清潔液(Cleaning Solution)配方1： 重鉻酸鉀 100g 蒸餾水 200ml 濃硫酸 800ml 將重鉻酸鉀加入蒸餾水中，使之自然溶解或水浴溶解，亦可在大坩堝中加熱溶解，然后慢慢加入濃硫酸，邊加邊攪拌，見發(fā)熱過劇則稍停，冷卻后再繼續(xù)加。此為強(qiáng)洗液。盛清潔液的容器要堅(jiān)固，上加厚玻璃蓋，操作時(shí)要穿橡皮圍裙、長(zhǎng)統(tǒng)膠靴、戴上眼鏡和厚膠皮手套，以保安全。洗液一旦變綠，表示鉻酸已經(jīng)還原，失去了氧化能力，不宜再用。如將這樣洗液加熱，再加適量重鉻酸鉀，

42、又可重新使用。 配方2： 重鉻酸鉀 60g 蒸餾水 300ml 濃硫酸 460ml 此為中等強(qiáng)度洗液。 配方3： 重鉻酸鉀 100g 蒸餾水 750ml 濃硫酸 250ml此液為弱洗液，為棕紅色。使用此液時(shí)，必須預(yù)先用熱肥皂水將玻璃器皿洗凈，經(jīng)自來水沖洗，瀝干然后才能浸入，否則該洗液很快失效。 （崔雪玲）氨芐青霉素（Ampicillin）     在9ml蒸餾水中溶解1g Ampicillin粉末并定容至10ml，然后用0.22 um微孔濾膜過濾除菌，分裝成小份存于-20。青、鏈霉素溶液：所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。具體操作均在超凈臺(tái)

43、內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。分裝于20保存。使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。3%酸性酒精溶液濃鹽酸 3ml 95%酒精97ml中性紅指示劑中性紅 004g 95%乙醇 28ml 蒸餾水 72ml 中性紅pH6.88，顏色由紅變黃，常用濃度為004%淀粉水解試驗(yàn)用碘液(盧戈氏碘液)碘片1g 碘化鉀 2g 蒸餾水 300ml  先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。溴甲酚紫指示劑

44、溴甲酚紫 004g  001mol/L NaOH 74ml 蒸餾水926ml   溴甲酚紫pH5268，顏色由黃變紫，常用濃度為004%。溴麝香草酚藍(lán)指示劑溴麝香草酚藍(lán)004g 001mol/L NaOH 64ml 蒸餾水 936ml  溴麝香草酚藍(lán)pH6076，顏色由黃變藍(lán)，常用濃度為004%。甲基紅試劑甲基紅(Methyl red) 004g 95%酒精 60ml 蒸餾水 40ml  先將甲基

45、紅溶于95%酒精中，然后加入蒸餾水即可。VP試劑15%-萘酚無水酒精溶液-萘酚5g 無水乙醇 100ml 240%KOH溶液KOH 40g 蒸餾水 100ml吲哚試劑對(duì)二甲基氨基苯甲醛 2g 95%乙醇 190ml 濃鹽酸40ml格里斯氏(Griess)試劑A液：對(duì)氨基苯磺酸05g 10%稀醋酸 150ml B液：-萘胺01g 蒸餾水 20ml 10%稀醋酸 150ml二苯胺試劑二苯胺05g溶于100ml濃硫酸中，用20ml蒸餾水稀釋十一、阿氏(Alsever)血液保存液檸檬酸三鈉·2H2O 8g 檸檬酸 05g 無水葡萄糖 187g NaCl 42g 蒸餾水 1000ml 將各成分

46、溶解于蒸餾水后，用濾紙過濾，分裝，056070kg/cm2(810磅/英寸2)，滅菌20分鐘。冰箱保存?zhèn)溆?。pH86離子強(qiáng)度0075mol/L巴比妥緩沖液巴比妥 276g 巴比妥鈉 1545g 蒸餾水 1000ml1%離子瓊脂瓊脂粉 1g 巴比妥緩沖液50ml 蒸餾水 50ml 1%硫柳汞 1滴稱取瓊脂粉1g先加至50ml蒸餾水中，于沸水浴中加熱溶解，然后加入50ml巴比妥緩沖液，再滴加1滴1%硫柳汞溶液防腐，分裝試管內(nèi)，放冰箱中備用。電泳緩沖液   50×Tris-乙酸（TAE）緩沖液成分及終濃度配制1L溶液各成分的用量2mol/L Tris堿1mol

47、/L 乙酸100 mmol/L EDTA  水 242g   57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L）200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）補(bǔ)足1L  1溴酚藍(lán)加1g水溶性鈉型溴酚藍(lán)于100ml水中，攪拌或渦旋混合直到完全溶解。1二甲苯青FF（xylene cyanole FF）溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。10mg/ml的溴化乙錠小心稱取1g溴化乙錠，轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，加100ml水，用磁力攪拌器攪拌直

48、到完全溶解。用鋁箔包裹裝液管，于4貯存。四常用抗生素氨芐青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20貯存。常以25ug/ml50ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。羧芐青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）溶解0.5g羧芐青霉素二鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20貯存。常以25ug/ml50ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）溶解1g甲氧西林鈉于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20貯存。常以37.5ug/ml終

49、濃度與100ug/ml氨芐青霉素一起添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基?？敲顾兀╧anamycin）（10mg/ml）溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20貯存。常以10ug/ml50ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）溶解250mg氯霉素足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20貯存。常以12.5ug/ml25ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。鏈霉素（streptomycin）（50mg/ml）溶解0.5g鏈霉素硫酸鹽于足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20貯存。常以10ug/ml5

50、0ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）溶解50mg萘啶酮酸鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20貯存。常以15ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。四環(huán)素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四環(huán)素鹽酸鹽于足量的水中，或者將無堿的四環(huán)素溶于無水乙醇，定容至10ml。分裝成小份用鋁箔包裹裝液管以免溶液見光，于-20貯存。常以10ug/ml50ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基五、常用貯存液的配制130%丙烯酰胺溶液【配制方法】將29g丙烯酰胺和1g N，N-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加

51、熱至37溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器（0.45m孔徑）過濾除菌，查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫?！咀⒁狻勘０肪哂泻軓?qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料。一些價(jià)格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂（MB-1 Mallinckrodt），攪拌過夜，然后用Whatman 1號(hào)濾紙過濾以純化之。在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。2

52、40%丙烯酰胺【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA測(cè)序級(jí)）和20g N，N-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸餾水中。繼續(xù)按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應(yīng)以蒸餾水補(bǔ)足至終體積為1L。【注意】見上述配制30%丙烯酰胺的說明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列測(cè)定。3放線菌素D溶液【配制方法】把20mg放線菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%乙醇作空白對(duì)照讀取OD440值。放線菌素D（分子量為1255）純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21，900，故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182，放線菌素D的貯存液應(yīng)放在包有箔片的試管中，保存于-20?！咀⒁狻糠啪€菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時(shí)必須戴手套并在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，而不能在開放在實(shí)驗(yàn)桌面上進(jìn)行，謹(jǐn)防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測(cè)量貯存液在440nm波長(zhǎng)處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導(dǎo)作用。40.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH調(diào)