大鼠神經(jīng)干細胞缺氧后的內(nèi)源性促紅細胞生成素表達規(guī)律

1、    大鼠神經(jīng)干細胞缺氧后的內(nèi)源性促紅細胞生成素表達規(guī)律             作者：孫崇毅，姚猛，陳立民，劉慶鵬，吉光榮，王巖松【關(guān)鍵詞】  缺氧     摘  要：目的觀察神經(jīng)干細胞缺氧后的內(nèi)源性促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）表達規(guī)律，初步探討缺氧預(yù)處理誘導(dǎo)神經(jīng)保護作用的機制。方法測定大鼠神經(jīng)干細胞缺氧培養(yǎng)4 h后不同時間的內(nèi)源性EPO

2、表達情況，以及預(yù)處理后不同時間，再次遭受致死劑量缺氧傷害后的EPO表達情況。結(jié)果缺氧時間為4 h，EPO蛋白在處理后即刻出現(xiàn)表達，4 h達高峰，8 h仍有部分表達。再次遭受致死劑量缺氧傷害后，與預(yù)處理4 h組相比，預(yù)處理24 h組細胞的EPO表達量明顯增多。結(jié)論缺氧預(yù)處理能夠提高神經(jīng)干細胞應(yīng)對傷害刺激時內(nèi)源性EPO的表達，并降低再次缺氧時誘導(dǎo)EPO表達的閾值。    關(guān)鍵詞：缺氧；  預(yù)處理；  干細胞；  促紅細胞生成素    Abstract：ObjectiveTo investigate the e

3、ndogenous erythropoietin expression of neural stem cells(NSCs) of rats after hypoxia.MethodWe used a rat NSCs culture model. EPO expression after 4 hours of hypoxia was studied. It was examined again following 12 hours of hypoxic lethal insult which was applied various times after hypoxic preconditi

4、oning. EPO expression was studied by western blotting.ResultFollowing the preconditioning, expression of EPO increased immediately and reached a peak 4 hours later.It lasted till 8 hours later.While applied the lethal hypoxia,EPO expression of cells in preconditioning 24 hours group were was signifi

5、cantly increased than that in preconditioning 4 hours group.ConclusionThe hypoxic preconditioning can lead an increased endogenous EPO expression and decrease the threshold of EPO expression against subsequent lethal stimulation during a certain period.    Key words：Hypoxia;  Pre

6、conditioning;  Stem cells;  Erythropoietin   脊髓損傷是一種致殘率很高的疾病。神經(jīng)功能恢復(fù)多不理想。神經(jīng)干細胞是一類具有自我更新能力和多種分化潛能的細胞，體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞移植治療脊髓損傷成為近年來研究的熱點之一。但細胞絕對數(shù)量和移植后局部微環(huán)境所限，使移植后細胞存活率不高1，限制了其神經(jīng)功能修復(fù)作用，影響移植效果。最近研究表明，短時間缺氧處理可以有效提高各種組織應(yīng)對傷害性刺激的能力，稱之為缺氧預(yù)處理。本研究通過體外實驗，探討大鼠神經(jīng)干細胞缺氧處理后內(nèi)源性促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）

7、表達的規(guī)律，以期為神經(jīng)干細胞缺氧預(yù)處理理論提供依據(jù)。    1  材料與方法    11  實驗材料    111  實驗動物    孕13天的SD（SpragueDawley）大鼠，由哈醫(yī)大二院動物中心提供。    112  主要試劑  DMEM/ F12 (11) （Gibco）；B27（Gibco）；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 和表皮生長因子(EGF)（Pepro Tech）；Ant

8、iNestin兔抗多克隆抗體 (武漢博士德)；AntiEPO兔抗多克隆抗體 (武漢博士德)；SP羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色盒(北京中杉)。    12  實驗方法    121  原代神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)  取孕13 d的SD大鼠脫頸椎處死，無菌條件下取出胎鼠大腦半球，冰浴下剝離腦膜及血管，將腦組織盡量剪碎，濾液離心（900 rmin，5 min），棄去上清液， 加入含20 g/L EGF、125 g/L bFGF和2B27的DMEM/F12（11）培養(yǎng)液中，吹散細胞后吸出，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，調(diào)整細

9、胞密度至1×105ml。23 d半量換液。    122  神經(jīng)干細胞的鑒定  行Nestin免疫組化，抗體工作濃度為1100，以PBS代替一抗作陰性對照。    123  缺氧預(yù)處理條件的應(yīng)用  無菌條件下,將95%N25% CO2的氣體通入DMEM/F12培養(yǎng)基中5 min，置換培養(yǎng)基及培養(yǎng)瓶中的氧氣，神經(jīng)干細胞用此培養(yǎng)基全量換液后，移入37 ，PO2為0條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)預(yù)定時間。以4 h為缺氧預(yù)處理條件，12 h為致死性缺氧處理條件。    124

10、  神經(jīng)干細胞缺氧處理后的EPO蛋白表達  以缺氧4 h為處理條件，檢測處理后不同時間EPO蛋白的表達。缺氧預(yù)處理后，分別繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4、24 h，給與致死性缺氧12 h處理，于處理后即刻、4 h檢測EPO蛋白的表達。未經(jīng)預(yù)處理的細胞做對照組。    檢測方法采用Western blot法，將待檢測細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS) 漂洗后，裂解緩沖液,作用30 min 后離心。凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)膜后, TTBS封閉。加入兔抗大鼠EPO抗體,4 孵育過夜,漂洗后加入相應(yīng)的特異性HRP二抗,37 作用60 min ,洗膜后ECL試劑盒顯色。以actin做

11、內(nèi)參照，用Total Lab v 201軟件定量檢測蛋白表達。    13  統(tǒng)計學(xué)處理    數(shù)據(jù)用SPSS 100軟件分析，t檢驗，P<001時有統(tǒng)計學(xué)意義。    2  結(jié)  果    21  細胞培養(yǎng)    原代取材，鏡下觀察可見大量細胞，胞體光滑圓潤，胞質(zhì)透亮，折光性強。24 h內(nèi)細胞開始聚集、分裂；57 d時，細胞聚集生長呈神經(jīng)球，懸浮生長。對所獲神經(jīng)球檢測顯示，球內(nèi)幾乎所有的細胞都呈Ne

12、stin陽性，說明培養(yǎng)所獲得的神經(jīng)球為神經(jīng)干細胞球。    22  神經(jīng)干細胞缺氧處理后的EPO表達    Western blot法顯示，未經(jīng)缺氧處理，NSCs幾乎無EPO表達；EPO蛋白的表達于處理后即刻開始出現(xiàn)，4 h最為明顯，8 h仍有少量表達（圖1）。 圖1  缺氧預(yù)處理后不同時間EPO的表達  1對照組（無缺氧）；2預(yù)處理后即刻；3預(yù)處理后2 h；4預(yù)處理后4 h；5預(yù)處理后6 h；6預(yù)處理后8 h致死性缺氧處理后，各組細胞EPO的表達見圖2，經(jīng)Total Lab軟件處理后的蛋白表達相對光密度

13、值見圖3。致死性缺氧處理后1 h，預(yù)處理4 h組和24 h組的EPO蛋白表達相對光密度值均明顯高于對照組，4 h組和24 h組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。致死性缺氧處理后4 h，對照組相對光密度較處理后1 h下降；預(yù)處理4 h組相對光密度較處理后1 h有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義；預(yù)處理24 h組相對光密度較處理后1小時明顯增加，統(tǒng)計學(xué)處理，P<001，說明該組細胞再次經(jīng)受致死性缺氧處理后4 h，其EPO蛋白表達明顯增多。 圖2  致死劑量缺氧處理后各組細胞EPO的表達  LH：致死劑量組  LH4：致死劑量后4 h組  PH4LH：預(yù)處理后4 h加致死劑量組

14、PH4LH4：預(yù)處理后4 h加致死劑量后4 h組  PH24LH：預(yù)處理后24 h加致死劑量組  PH24LH4：預(yù)處理后24 h加致死劑量后4 h組  圖3  缺氧預(yù)處理對大鼠神經(jīng)干細胞EPO表達相對光密度值的影響  1LH  2LH4  3PH4LH  4PH4LH4  5PH24LH  6PH24LH4  P<001  P>001    3  討  論    脊髓損傷后的神經(jīng)功能

15、修復(fù)一直是困擾臨床醫(yī)師的難題之一。長期以來認為，成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)是不可能再生的，即神經(jīng)元是終末細胞，不能通過分裂增殖產(chǎn)生新神經(jīng)元以替換死亡的神經(jīng)元。因此，脊髓損傷的治療更多著眼于繼發(fā)性損傷的處理，神經(jīng)組織受損導(dǎo)致的功能喪失成為不可逆的過程。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)提供了重要的途徑，成為近年來的研究熱點2，這一發(fā)現(xiàn)改變了神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能“再生”的傳統(tǒng)概念。由于干細胞的多潛能分化特性，體外培養(yǎng)、擴增的神經(jīng)干細胞重新移植至體內(nèi)，他們不但能生長、存活，而且能遷移分化并發(fā)揮功能。這些過程是受局部環(huán)境中的特異性信號調(diào)控3，同時受到移植區(qū)局部環(huán)境內(nèi)各種有害因素的影響4，使得存活的神經(jīng)干

16、細胞比例過低。細胞密度低于一定水平時，細胞間各種因子、分子的濃度就達不到神經(jīng)干細胞生長的要求，從而又進一步不利于其生長分化，形成惡性循環(huán)，這也正是影響移植效果的重要原因1。因此，提高植入的神經(jīng)干細胞抵御周圍傷害性因素的影響，提高存活率，是取得移植成功的關(guān)鍵之一。    近年來，有學(xué)者提出了“預(yù)處理”的概念，這是細胞的一種內(nèi)源性保護機制，是指亞致死性傷害性刺激作為預(yù)處理，可以對繼之而來的致死性傷害提供一種保護作用。國內(nèi)外的大量研究表明，這一保護性機制廣泛存在于器官、組織、細胞水平，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也有發(fā)生5。因此，作者可以大膽地假設(shè)，這種預(yù)處理效應(yīng)對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞

17、同樣存在。缺氧是細胞移植后最普遍的傷害刺激之一，因此，作者將缺氧作為刺激條件。而且相對于一些在體研究，在移植前進行離體細胞預(yù)處理，可以更有效保證受體的安全，使這項技術(shù)具有可操作性。    許多學(xué)者認為，機體組織缺氧后會提高缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）1亞型的表達，HIF1通過作用其下游靶基因介導(dǎo)了缺氧后的一系列病理生理變化，而EPO基因正是HIF1最為重要的下游基因之一。 EPO是一種調(diào)節(jié)紅細胞生成的糖蛋白，近年來的研究表明，它同時還具有內(nèi)源性的神經(jīng)保護作用，可應(yīng)用于各種神經(jīng)組織損傷的治療。在各類神經(jīng)組織的缺氧預(yù)處理過程中，EPO也發(fā)揮了重要的作用，如神經(jīng)元6、視網(wǎng)膜7

18、等。有關(guān)神經(jīng)干細胞缺氧預(yù)處理的研究雖無報道，但Tetsuro8證實，一定強度的缺氧可以促進體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞EPO mRNA產(chǎn)物的增多以及細胞增殖。    本實驗通過Western Blot法，在蛋白水平上進一步證實了神經(jīng)干細胞缺氧后EPO表達的變化。EPO蛋白的表達于缺氧后即刻開始出現(xiàn)， 4 h最為明顯，持續(xù)約8 h，和Tetsuro等在EPO基因水平上得出的結(jié)論基本一致8。但同時也說明預(yù)處理劑量的缺氧尚不足以誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生持久穩(wěn)定的EPO濃度。但再次經(jīng)受致死劑量的缺氧后，預(yù)處理后24 h的神經(jīng)干細胞的EPO表達明顯多于其它組細胞。因此，我們有理由認為，缺氧預(yù)處理

19、可以提高神經(jīng)干細胞再次遭受致死劑量缺氧時的內(nèi)源性保護能力，其原因不完全是因為預(yù)處理提高了細胞本身EPO的表達量，更重要的是降低了再次應(yīng)激時誘導(dǎo)EPO表達的閾值。這種閾值的降低出現(xiàn)在預(yù)處理后24 h，而不是4 h，說明神經(jīng)保護作用需要一個誘導(dǎo)過程，誘導(dǎo)時間和持續(xù)時間在體外和體內(nèi)實驗中都是不同的，同時和實驗用動物的種屬差異也有關(guān)系。另一個值得提出的問題是，這種保護作用具有普遍性。Eisen等9認為，缺氧預(yù)處理不僅僅針對進一步的缺氧損傷，而對于其他形式的傷害方式也同樣具有保護作用。這體現(xiàn)了缺氧預(yù)處理的廣泛性和非特異性，使其更具有應(yīng)用價值。有關(guān)大鼠神經(jīng)干細胞缺氧預(yù)處理的動物體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)尚需進一步的研究

20、。    參考文獻：    1  Rossi F,Cattaneo E.Opinion: neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and realityJ.Nat Rev Neurosci, 2002,3(5):401-409.    2  馬云青,羅卓荊. 脊髓神經(jīng)干細胞的研究進展及應(yīng)用前景J. 中國矯形外科雜志, 2005(04).    3  Zhu G,Mehl

21、er MF, Mabie PC, et al. Developmental changes in neural progenitor cell lineage commitment do not depend on epidermal growth factor receptor signalingJ. J Neurosci Res, 2000,59(3):312-320.    4  Fishell G.Striatal precursors adopt cortical identities in response to local cuesJ. D

22、evelopment, 1995,121(3):803-812.    5  Prass K, Scharff A, Ruscher K, et al. Hypoxiainduced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietinJ. Stroke, 2003,34(8):1981-1986.    6  Liu J,Narasimhan P, Yu F, et al. Neuroprotection by hypoxic preconditioning involves oxidative stressmediated expressi