原核蛋白表達(dá)（上清表達(dá)）案例

1、原核蛋白表達(dá)（上清表達(dá)）案例原核蛋白表達(dá)（上清表達(dá)）案例1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊钥蛻籼峁┑哪康牡鞍谆驑?gòu)建表達(dá)載體，通過(guò)原核蛋白表達(dá)體系獲得目的蛋白A。2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1） 分析客戶提供的目的蛋白序列，設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)方案；（2）選擇鐘鼎特色載體pCzn1，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pCzn1-A；（3） IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行目的蛋白表達(dá)，并且優(yōu)化表達(dá)條件，將誘導(dǎo)條件調(diào)整至37，經(jīng)分析目標(biāo)蛋白主要呈可溶形式表達(dá)，通過(guò)Western Blot檢測(cè)蛋白A是否表達(dá)； （4）通過(guò)上清純化方式，Ni柱親和純化獲得目的蛋白A，SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白純度，BSA方法測(cè)定蛋白濃度。3. 蛋白分析（1）經(jīng)EditSeq翻譯目的蛋白A序

2、列：m.w.=10.66kd，pI=6.64（2）經(jīng)UniProt匹配，蛋白A物種來(lái)源：擬南芥（3）目的基因稀有密碼子分析及蛋白結(jié)構(gòu)分析蛋白親疏水分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析結(jié)果：目的蛋白整體呈親水性、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域、無(wú)信號(hào)肽序列，可嘗試全長(zhǎng)表達(dá)。結(jié)論：將目的基因構(gòu)建在鐘鼎特色載體pCzn1上，可用于原核表達(dá)上清表達(dá)，利用載體自帶信號(hào)肽分泌表達(dá)，并在目的蛋白N端添加His標(biāo)簽便于純化。4. 表達(dá)載體構(gòu)建4.1 pCzn1-A質(zhì)粒酶切驗(yàn)證：鐘鼎特色載體pCzn1酶切鑒定Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500Line1: 酶切前質(zhì)粒Line2: 酶切后質(zhì)粒基因名稱：A（OD260/OD280:1.82）酶切位點(diǎn)：NdeI/XbaI 4.2 pCzn1-A質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證：部分序列比對(duì)結(jié)果圖5.蛋白表達(dá)及純化蛋白表達(dá)鑒定SDS-PAGE分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: 未誘導(dǎo)2: 誘導(dǎo)后3: 誘導(dǎo)破碎后上清4: 誘導(dǎo)破碎后沉淀 蛋白純化SDS-PAGE分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1: 破碎后處理樣品2: 流出3: 洗脫蛋白Western Blot鑒定分析M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1