溶組織內(nèi)阿米巴培養(yǎng)VIP

1、第十八章寄生蟲(chóng)的人工培養(yǎng)及動(dòng)物模型第一節(jié)寄生蟲(chóng)的人工培養(yǎng)一、溶組織內(nèi)阿米巴培養(yǎng)可分有菌培養(yǎng)(xenicculture)和無(wú)菌培養(yǎng)(axenicculture)(一)有菌培養(yǎng)主要用Robinsons培養(yǎng)基，不僅可以培養(yǎng)溶組織內(nèi)阿米巴，也可以培養(yǎng)哈門氏內(nèi)阿米巴、結(jié)腸內(nèi)阿米巴、微小內(nèi)蜒阿米巴等多種阿米巴。一般應(yīng)用6ml7ml或更小的螺旋有蓋培養(yǎng)管。1組成成分：(1)鹽水瓊脂斜面：溶解15g瓊脂粉和7g8g氯化鈉于1000ml蒸餾水中，分裝在小試管中高壓滅菌(121,15min)，當(dāng)瓊脂冷卻至75左右傾放使其形成斜面。(2)紅霉素：將0.5g實(shí)驗(yàn)室用紅霉素粉劑置于無(wú)菌容器中，加入20ml70%乙醇溶解

2、，4放置2h以上，而后加滅菌水至50ml。(3)米粉：梗米粉經(jīng)高壓消毒或180干燥滅菌。(4)配制50mmol鄰苯二甲酸氫鉀，pH6.3,高壓滅菌。(5)血清：5630min滅活，甚至未滅活的牛或馬血清均可使用。(6) R溶液貯存液：NaCl50g(NH4)2SO10g檸檬酸.2H2020gMgSO4.7H2O0.5gKH2PO45g乳酸(90%屯度)4ml,力口水至950ml,調(diào)節(jié)pH至7.0,最終調(diào)節(jié)容量至1000ml,分裝高壓滅菌，制備成貯存工作液。使用時(shí)將100ml貯存液加入850ml雙蒸水，調(diào)節(jié)pH7.0分裝高壓滅菌。(7) BR溶液：25mlR工作液與1個(gè)克隆的大腸桿菌，37c振搖

3、培養(yǎng)48小時(shí)。(8) BRS容液：在上述BR溶液中加入等量血清，繼續(xù)培養(yǎng)2448小時(shí)即可。2.操作步驟在含瓊脂斜面的培養(yǎng)試管中加入10mg米粉、120H紅霉素液和足夠遮蓋斜面量的鄰苯二甲酸氫鉀和BRS夜4:1混合液，加入少量(約50mg讀便，混勻，37c培養(yǎng)24小時(shí)后，移去培養(yǎng)上清液，加適量入4:1混合液并加入60內(nèi)紅霉素和米粉。37c繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，取米粉與糞渣混合物一滴，以碘液染色或直接觀察有無(wú)滋養(yǎng)體；若未發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體再加入米粉，再培養(yǎng)24小時(shí)觀察。若蟲(chóng)體陽(yáng)性可將少量培養(yǎng)混合液轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，即為轉(zhuǎn)種。(二)無(wú)菌培養(yǎng)最常用是BIS-33培養(yǎng)基，為液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)在6ml的玻璃有蓋

4、培養(yǎng)管中，由于阿米巴為兼性厭氧代謝，故應(yīng)緊蓋管蓋，并呈5。的角度放置。蟲(chóng)體對(duì)培養(yǎng)基和血清的要求甚高，甚至水質(zhì)也會(huì)影響其生長(zhǎng)，并非一般實(shí)驗(yàn)室可行。目前我國(guó)生產(chǎn)的培養(yǎng)基試劑尚不能成功培養(yǎng)蟲(chóng)體。BIS-33培養(yǎng)基含三個(gè)組分，即營(yíng)養(yǎng)液、維生素混合液、成牛血清。(1)營(yíng)養(yǎng)液：KHPO1.0gKH2PO0.6gNaCl2gL半胱氨酸-HCl1g維生素C0.2g枸椽酸鐵胺22.8mg葡萄糖10g消化蛋白月東，酵母提取物30g溶于600ml雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH至6.8,最終容量調(diào)至870ml,分裝，高壓消毒后，冷卻至-20項(xiàng)t存。(2)維生素培養(yǎng)液有多種，如下一種是最易配制的。溶液A:煙酰胺45mg;鹽酸維生素

5、B64mg;泛酸鈣23mg;鹽酸硫胺5mg;維生素B121.2mg,均溶于雙蒸水，定容至25ml;溶液B:核黃素7mg偽口0.1NNaOH數(shù)微升使其易溶解)加雙蒸水至45ml;溶液C:葉酸5.5mg(加0.1NNaOHK微升使其易溶解)加雙蒸水至45ml;溶液D:d-生物素2mg加雙蒸水至45ml;溶液E:DL-6,8-硫辛酸1mg溶于5ml95%乙醇中，加入500mgTween80并定容至200ml,0.2Rm濾膜過(guò)濾滅菌，4c暗處保存。(3)成牛血清成牛血清需經(jīng)4小時(shí)左右滅活方可用于培養(yǎng)，但需避免反復(fù)凍融。(4)完全培養(yǎng)劑營(yíng)養(yǎng)液87ml,成牛血清10ml或15ml,維生素混合液2ml,混合

6、，冷藏，隨時(shí)可用。應(yīng)用6ml的螺旋有蓋培養(yǎng)管，36±0.5C培養(yǎng)，7296小時(shí)轉(zhuǎn)種一次?？蓪⑾蛴芯囵B(yǎng)的滋養(yǎng)體與37c的BIS-33培養(yǎng)基混勻，使米粉等粗顆粒自然沉淀，取含滋養(yǎng)體的上清液通過(guò)濾紙，400g2min離心，棄上清液。將含滋養(yǎng)體的沉淀溶入含青霉素、鏈霉素、卡那霉素、多粘菌素的BIS-33培養(yǎng)液中，并加入數(shù)滴福爾馬林固定的短膜蟲(chóng)，在6ml螺旋有蓋培養(yǎng)管中培養(yǎng)。24小時(shí)后可見(jiàn)滋養(yǎng)體貼附試管壁，換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)或72小時(shí)后轉(zhuǎn)種，使其逐漸轉(zhuǎn)為無(wú)菌培養(yǎng)，并可進(jìn)一步克隆化。二、陰道毛滴蟲(chóng)培養(yǎng)可分有菌培養(yǎng)和無(wú)菌培養(yǎng)。1 .有菌培養(yǎng)主要是肝月東糖培養(yǎng)基。一般應(yīng)用12ml或6m

7、l的螺旋有蓋培養(yǎng)管，可從病人陰道后穹隆取材直接放入培養(yǎng)管中，加入青霉素1000u/ml,鏈霉素1mg/ml,以除去雜菌，36=0.5C培養(yǎng)。具體配制方法為，取小牛肝臟60g,清洗粉碎，浸入400ml蒸儲(chǔ)水中，4c過(guò)夜。而后煮沸1小時(shí)左右，紗布過(guò)濾，最終調(diào)節(jié)容量至400ml,分裝，4c貯存。取100ml上述肝浸湯加入蛋白月東2g和葡萄糖0.5g,調(diào)節(jié)pH至5.56.0,5ml或2.5ml分裝，20分鐘高壓滅菌,使用前加入15煩活牛血清。2 .無(wú)菌培養(yǎng)應(yīng)用前述的BIS-33培養(yǎng)基，將pH調(diào)節(jié)至5.8，應(yīng)用10誠(chéng)牛血清,培養(yǎng)管如同阿米巴培養(yǎng)所用。從有菌轉(zhuǎn)入無(wú)菌時(shí)，應(yīng)加入適量適當(dāng)?shù)目咕匾詺⑺兰?xì)菌，例

8、如青霉素、鏈霉素、卡那霉素等。三、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)培養(yǎng)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)可以直接從病人糞便或十二指腸液或膽汁中直接進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，而無(wú)需從有菌培養(yǎng)或混合培養(yǎng)(monoxenicculture)轉(zhuǎn)化。所用試管如溶組織內(nèi)阿米巴無(wú)菌培養(yǎng)所述，培養(yǎng)溫度36±0.5C。培養(yǎng)基即為BIS-33,但可作如下改良即：L-半胱氨酸-HCl加倍；每1升培養(yǎng)液加入500mg兌氫牛膽汁(dehydrogenatebovinebile);pH為7.07.2;培養(yǎng)液以0.2Nm的濾膜過(guò)濾除菌，在過(guò)濾前高速離心可以除去較大的雜質(zhì)以便過(guò)濾。應(yīng)用10%的成牛血清。無(wú)需維生素混合液。四、隱抱子蟲(chóng)培養(yǎng)在隱抱子蟲(chóng)生活史中只有囊合子

9、和子抱子可以從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或感染者分離，而后進(jìn)行體外培養(yǎng)。首先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或感染者糞便搗成勻漿，過(guò)濾，而后與飽和鹽水混勻，1000g15min離心。取含囊合子的上層液，以雙蒸水3:1稀釋，4000g15min離心。沉淀以0.1%硫代硫酸鹽溶液洗滌、離心，沉淀再溶于生理鹽水，以Percoll梯度分離，所得囊合子加入適當(dāng)抗菌素可在4c中貯存68周。在進(jìn)行體外培養(yǎng)前囊合子可以1.75%的低氯溶液(hypochlorite)處理7min,而后轉(zhuǎn)入人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)、牛輸卵管上皮細(xì)胞或猴腎上皮細(xì)胞(MDBK)的培養(yǎng)瓶中以相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，囊合子可以增殖，但少于動(dòng)物腸內(nèi)培養(yǎng)，可用于研究宿主細(xì)胞與病

10、原體的相互關(guān)系和藥物篩選。五、利什曼原蟲(chóng)培養(yǎng)（一）前鞭毛體培養(yǎng)1 .培養(yǎng)基主要有NNN（3N培養(yǎng)基和USMARU養(yǎng)基。NNNg養(yǎng)基可以分固體部分和體部分。固體部分：1.4g瓊脂、0.6g氯化鈉加入90ml雙蒸水，加熱溶解，每4ml或1.5ml分裝入12ml或6ml培養(yǎng)管中，12115min滅菌，而后加入去纖維素的兔血至15%含量，混合并放成斜面，4保存。液體部分為少量的滅菌雙蒸水，還可加入青霉素和鏈霉素。培養(yǎng)溫度在2027c左右。USMARU養(yǎng)基是將“Bacto”血瓊脂4g溶于雙蒸水中，以后制法如NNNg養(yǎng)基。2 操作步驟取皮膚或組織、骨髓的活檢標(biāo)本加入培養(yǎng)管中，2025培養(yǎng)。每23天取極少量

11、培養(yǎng)液觀察是否有前鞭毛體，一旦發(fā)現(xiàn)有前鞭毛體則應(yīng)立即取數(shù)滴培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中。另有Schneider'sDrosoph崎養(yǎng)基根據(jù)昆蟲(chóng)血淋巴液的成份加胎牛血清配制而成。蟲(chóng)體在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，但價(jià)格昂貴。有許多株的利什曼原蟲(chóng)還可以成功地培養(yǎng)在一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的混合液中，例如MEM、RPMI1640或199培養(yǎng)基。（二）無(wú)鞭毛體培養(yǎng)利什曼原蟲(chóng)的無(wú)鞭毛體寄生在哺乳動(dòng)物的單核吞噬細(xì)胞內(nèi)，也可以體外培養(yǎng)在這類細(xì)胞內(nèi)，例如可在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)株J774G8內(nèi)培養(yǎng)或在直接從外周血分離的巨噬細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)。前者巨噬細(xì)胞分裂，且蟲(chóng)體大量增殖，但有時(shí)會(huì)混有前鞭毛體。后者則適用于短期的實(shí)驗(yàn)，雖然蟲(chóng)體自身

12、增殖，但巨噬細(xì)胞并不分裂。無(wú)鞭毛體還可以生長(zhǎng)在無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基中。這種無(wú)鞭毛體可以被巨噬細(xì)胞迅速吞噬，并在細(xì)胞內(nèi)分裂，可轉(zhuǎn)化為前鞭毛體。一般培養(yǎng)溫度為33，每96小時(shí)轉(zhuǎn)種一次。六、瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)可以分紅細(xì)胞內(nèi)期和紅細(xì)胞外期。紅細(xì)胞內(nèi)期培養(yǎng)中四種人體瘧原蟲(chóng)僅惡性瘧原蟲(chóng)可以成功地在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)。瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)比較復(fù)雜，需要"O'型人紅細(xì)胞、人血清及由3%（氣、4%1氧化碳和93%氮?dú)饨M成的氣體充在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。當(dāng)然還需要基本的培養(yǎng)液例如RPMI1640等，而且必須每天更換。整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)也必須是無(wú)菌狀態(tài)的。這里例舉一種培養(yǎng)方法：取新鮮"O'型抗凝全血，離心使血清與紅細(xì)

13、胞分離開(kāi)來(lái)。血清按一次需要量分裝于小容量的無(wú)菌瓶或試管中，-20保存。紅細(xì)胞以RPMI1640洗滌三次后，懸浮在等量的含10%人血清的RPMI1640中，4保存，可使用23周。市售的RPMI1640液體培養(yǎng)液或粉末培養(yǎng)基溶解過(guò)濾滅菌后，加入HEPES和谷胱苷肽，使最終濃度分別為25mmol/l和0.6%，成為完全的RPMI1640的培養(yǎng)液。培養(yǎng)時(shí)取病人血，以RPMI1640洗滌2次，再加入含15%人血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液，使再成為含量約為0.2%0.4%的懸液。取懸液8ml置35cm2（70ml）無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再加入紅細(xì)胞懸液，使其最終成為3%5%紅細(xì)胞懸液，充入上述混合氣體，緊

14、蓋瓶蓋，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般24小時(shí)更換培養(yǎng)液一次。換液時(shí)盡量不晃動(dòng)細(xì)胞層，不觸及紅細(xì)胞，以消毒吸管除去老培養(yǎng)液。加入等量新鮮的含15%人血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液后再輕輕懸浮細(xì)胞，37繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)定時(shí)吸取少量沉淀細(xì)胞涂成簿血片，姬氏染色，了解蟲(chóng)體生長(zhǎng)情況。紅細(xì)胞外期的培養(yǎng)惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)可以成功。這對(duì)開(kāi)展瘧原蟲(chóng)疫苗研究很有意義，目前已有這方面的專著，故具體方法不在這里敘述。七、血吸蟲(chóng)培養(yǎng)在血吸蟲(chóng)的培養(yǎng)中，體外培養(yǎng)并不十分成功。以對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)的研究最多，發(fā)展最快。血吸蟲(chóng)培養(yǎng)主要分為螺期蟲(chóng)體的培養(yǎng)和終宿主期蟲(chóng)體的培養(yǎng)。所選用的培養(yǎng)基和不同動(dòng)物來(lái)源的血清對(duì)蟲(chóng)體的影響很大。在這方面需

15、不斷的研究，以改變目前蟲(chóng)體往往發(fā)育不規(guī)則、不正?；虺上x(chóng)產(chǎn)卵量少、產(chǎn)異常卵的情況。關(guān)于血吸蟲(chóng)的培養(yǎng)的具體方法和培養(yǎng)基也已有專著。另外對(duì)豬肉絳蟲(chóng)、豬囊尾蚴、牛肉絳蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、絲蟲(chóng)等的成蟲(chóng)或幼蟲(chóng)均可以在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這對(duì)這些蟲(chóng)體的生理生化、代謝、免疫、遺傳的研究均有意義，但限于篇幅，不再贅述。第二節(jié)寄生蟲(chóng)的動(dòng)物模型一、溶組織內(nèi)阿米巴腸道阿米巴病模型：將通過(guò)中華倉(cāng)鼠肝臟的增加了毒力的溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體通過(guò)小鼠的肛門灌注入直腸、乙狀結(jié)腸可引起大量滋養(yǎng)體侵入腸粘膜而引起潰瘍。并可在糞便中檢獲滋養(yǎng)體、包囊或抗原。肝阿米巴病模型：將具毒力的溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體105106注入中華倉(cāng)鼠肝臟包膜下，

16、7天后解剖可見(jiàn)肝臟具有占位性病變，并可在膿液中檢獲滋養(yǎng)體。杜氏利什曼原蟲(chóng)將稀釋的杜氏利什曼原蟲(chóng)病患者稀釋的組織穿刺液或人工感染杜氏利什曼原蟲(chóng)動(dòng)物的脾、肝組織研磨勻漿0.5ml，注入中華倉(cāng)鼠等動(dòng)物腹腔內(nèi)，1個(gè)月內(nèi)解剖動(dòng)物，可見(jiàn)其肝、脾淋巴結(jié)等含有無(wú)鞭毛體。原蟲(chóng)可在倉(cāng)鼠體內(nèi)存活六個(gè)月左右。3、 剛地弓形蟲(chóng)將病人的組織穿刺液，注入健康小鼠腹腔內(nèi)，約23周后取小鼠腹腔液行涂片檢查，可見(jiàn)滋養(yǎng)體集于腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)，少數(shù)散于細(xì)胞外。收集腹腔液，溶解細(xì)胞，最終過(guò)濾可以收集到純的滋養(yǎng)體。被收集腹腔液的小鼠可繼續(xù)培養(yǎng)，23天后繼續(xù)抽腹腔液收集滋養(yǎng)體，可反復(fù)23次，但每次抽取腹腔液必須注意無(wú)菌操作。液氮保存蟲(chóng)株的滋

17、養(yǎng)體注入健康小鼠腹腔內(nèi)，約7天后取小鼠腹腔液行涂片檢查，可見(jiàn)滋養(yǎng)體集于腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)或散于細(xì)胞外。4、 瘧原蟲(chóng)四種感染人體的瘧原蟲(chóng)的動(dòng)物模型均為靈長(zhǎng)類動(dòng)物，十分昂貴。但是這些動(dòng)物模型的存在為瘧疾的研究提供了有利的條件，但也應(yīng)探索應(yīng)用小型動(dòng)物作為人瘧原蟲(chóng)的動(dòng)物模型。5、 卡氏肺孢子蟲(chóng)正常大鼠反復(fù)給予腎上腺皮質(zhì)激素，使其抵抗力下降。此時(shí)人肺孢子蟲(chóng)可成功感染大鼠。這為卡氏肺孢子蟲(chóng)的形態(tài)、生活史，尤其是分子生物學(xué)和制備單克隆抗體提供了良好的模型。六、旋毛蟲(chóng)將含旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的肉類（含幼蟲(chóng)200條左右）搗碎喂養(yǎng)正常小鼠或大鼠，經(jīng)5周左右可在動(dòng)物的肌肉內(nèi)檢獲幼蟲(chóng)包囊，亦可將含幼蟲(chóng)的肉類搗碎加酶消化，收集幼蟲(chóng)。直接經(jīng)腹腔注入正常小鼠（或大鼠）體內(nèi)，經(jīng)5周亦可同樣檢獲幼蟲(chóng)。7、 血吸蟲(chóng)血吸蟲(chóng)常用而經(jīng)濟(jì)的動(dòng)物模型為家兔或小鼠。將從陽(yáng)性釘螺逸出的尾蚴500條800條或4