免疫學(xué)診斷及檢測(cè)技術(shù)-

1、現(xiàn)已明確支氣管哮喘是以氣道炎癥細(xì)胞(包括嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等浸潤(rùn)為主要病理特征的免疫性疾病。在其發(fā)病過程中,免疫系統(tǒng)的多種成分如T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、免疫球蛋白、細(xì)胞因子和粘附因子等起著關(guān)鍵的作用。對(duì)這些成分的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)有助于闡明支氣管哮喘的病因、發(fā)病過程以及對(duì)疾病嚴(yán)重程度的r解,并可指導(dǎo)支氣管哮喘的治療。這些檢測(cè)大致可分為特異性的免疫學(xué)檢測(cè)和非特異性的免疫學(xué)檢測(cè)兩大類。第一節(jié)特異性免疫學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)特異性免疫試驗(yàn)主要包括體內(nèi)過敏試驗(yàn)、體外特異性IgE抗體的檢測(cè)、嗜堿性粒細(xì)胞釋放能力的檢測(cè)等,這些試驗(yàn)可以直接或間接反映引起支氣管哮喘發(fā)作的過敏原、體內(nèi)特異性IgE的水平。一、體內(nèi)過

2、敏試驗(yàn)主要有過敏原皮試和激發(fā)試驗(yàn)兩種。(一過敏原皮試過敏性哮喘患者產(chǎn)生的針對(duì)某一種或多種過敏原的IgE或IgG4與皮膚粘膜下層的肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞Fe受體結(jié)合。局部接觸過敏原后,引起I型變態(tài)反應(yīng),從而使局部充血,水腫,形成風(fēng)團(tuán)和紅暈等臨床表現(xiàn),故我們通過皮試來了解過敏性哮喘患者的過敏原以及機(jī)體的敏感狀態(tài)和脫敏的療效。常用的過敏原皮試法有皮內(nèi)試驗(yàn)、點(diǎn)刺法、抓痕法、斑貼法、被動(dòng)皮膚轉(zhuǎn)移試驗(yàn)法等五種,其中前兩種的應(yīng)用較為廣泛。皮試的部位一般采用上臂的伸側(cè),也可在大腿或背部。1.皮內(nèi)試驗(yàn)(intradermal test 常用過敏原皮試液的濃度為1:100,對(duì)于花粉浸液則可用l1000或1:100

3、00。方法及步驟:酒精消毒局部皮膚后,用1ml注射器分別吸入不同過敏原的皮試液,在受試部位依次注入皮內(nèi)0.02ml,使之形成一3-4mm直徑的皮丘。為避免結(jié)果互相影響,相鄰皮丘間距為3cm左右。15分鐘后觀察結(jié)果。有些患者反應(yīng)較遲,可在皮試后30分鐘時(shí)再觀察一次。皮內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果主要表現(xiàn)為風(fēng)團(tuán)和紅暈,其分級(jí)判斷標(biāo)準(zhǔn)參見表14-1。 皮內(nèi)法結(jié)果敏感、準(zhǔn)確、重復(fù)性較好,但由于其注入的過敏原量較多,有可能使高度敏感的病人產(chǎn)生過敏性哮喘或過敏性休克等全身反應(yīng),因此有一定的危險(xiǎn)性。此外,該試驗(yàn)結(jié)果的假陽性率比較高。2點(diǎn)刺試驗(yàn)(prick test 所用過敏原皮試液的濃度為皮內(nèi)法的10 N100倍。方法及步

4、驟:先在皮試部位滴上一滴過敏原皮試液,然后用特制的點(diǎn)刺針在滴有皮試液的皮膚中央進(jìn)行點(diǎn)刺,點(diǎn)刺的深度以不引起出血為度。1分鐘后擦去皮試液,15分鐘后觀察結(jié)果,以局部出現(xiàn)風(fēng)團(tuán)和紅暈為陽性反應(yīng)。其結(jié)果分級(jí)判斷標(biāo)準(zhǔn)參見表14-2: 點(diǎn)刺法優(yōu)點(diǎn):同皮內(nèi)法相比,其方法更為簡(jiǎn)單;患者的局部疼痛比較輕;易于為患者所接受;進(jìn)入患者體內(nèi)的過敏原量比皮內(nèi)法少得多,因而引起全身過敏反應(yīng)的可能性小,比較安全;假陽性率也比較低。目前,國內(nèi)外皮試多采用此法。但該法的敏感性不如皮內(nèi)法,而且對(duì)皮試結(jié)果的分級(jí)不如皮內(nèi)法明顯。3.劃痕法( scratch test 方法及步驟:用消毒后的粗針頭在局部皮膚劃痕,其深度也是以不出血為度

5、,每一痕長(zhǎng)為0.5cm,相鄰兩條痕之間間隔約3cm。然后依次滴上過敏原皮試液或?qū)φ找?十五分鐘后觀察結(jié)果。劃痕部位隆起并繞以紅暈者為陽性。該法優(yōu)點(diǎn)是不引起疼痛,尤適用于兒童。但由于進(jìn)入皮內(nèi)的過敏原量難以控制,故準(zhǔn)確性較差。4斑貼法(patch test 方法及步驟:在病人的前臂曲側(cè)皮膚上滴上一滴O.lN的NaOH 溶液用來軟化皮膚表面的角質(zhì)層。擦干后,將純凈的過敏原研成粉末,置于該處。滴上生理鹽水或人工汗液(其主要成份含氯化鈉13、乳酸2、脂酸2、硫酸鈉l%、尿素l%,輕輕拌勻后,覆蓋一層塑料薄膜,再用紗布包扎。2448小時(shí)后觀察結(jié)果。以出現(xiàn)紅暈、丘疹、水皰者為陽性反應(yīng),該試驗(yàn)的觀察時(shí)間長(zhǎng),假

6、陽性和假陰性率均比較高,因而目前已不常用于哮喘病的病因?qū)W診斷,但仍是皮膚科用于接觸性變應(yīng)原診斷的重要手段之一。5.被動(dòng)皮膚轉(zhuǎn)移試驗(yàn)( passive transfer test 該法由德國的Prallsnitz和Kustner于1921年共同發(fā)現(xiàn),故又稱為P-K試驗(yàn)。方法及步驟:采取病人全血后,分離血清(內(nèi)含特異性IgE,然后在受試者皮內(nèi)注入O.lml病人血清,并在注入處做好標(biāo)記,于2448小時(shí)后,在受試者皮膚的原血清注入處進(jìn)行各種過敏原皮試。被動(dòng)皮膚轉(zhuǎn)移試驗(yàn)適用于皮膚反應(yīng)性過強(qiáng)(如皮膚劃痕征陽性或過弱(注射1:10000的磷酸組胺后皮膚無反應(yīng)以及皮膚廣泛病變而不能進(jìn)行自身過敏原皮試的患者。其

7、缺點(diǎn)是易傳播乙肝、梅毒、愛滋病等傳染性疾病,故病人試驗(yàn)前應(yīng)注意對(duì)這些傳染性疾病進(jìn)行檢測(cè)。隨著體外檢測(cè)特異性IgE技術(shù)的不斷發(fā)展本法已經(jīng)很少應(yīng)用于臨床,主要在研究時(shí)應(yīng)用。過敏原皮試同其它方法比,具有敏感性高,檢測(cè)速度快,重復(fù)性好,操作簡(jiǎn)單,費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。但是,應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到,支氣管哮喘的靶器官是在支氣管,而不是在皮膚。因此,過敏原皮試的結(jié)果與實(shí)際上引起患者支氣管哮喘發(fā)作的過敏原種類及其反應(yīng)程度之間有一定的差距。必要時(shí),應(yīng)進(jìn)行過敏原氣道激發(fā)試驗(yàn)或直接檢測(cè)抗原特異性IgE。(二激發(fā)試驗(yàn)(provocation tests對(duì)于一些皮膚反應(yīng)性過強(qiáng)或過弱不適合皮試,以及皮試結(jié)果與臨床癥狀不符的病人可進(jìn)一步采用

8、激發(fā)試驗(yàn)。常用的激發(fā)試驗(yàn)有支氣管激發(fā)試驗(yàn)及鼻粘膜激發(fā)試驗(yàn)等。1.支氣管激發(fā)試驗(yàn)( bronchial provocation test,BPT BPT在支氣管哮喘的病因診斷,發(fā)病機(jī)理和免疫治療方面的研究具有重要價(jià)值。它是通過讓患者霧化吸入過敏原后觀察患者有無哮喘發(fā)作及肺通氣功能的變化情況,從而明確引起哮喘發(fā)作的過敏原種類以及機(jī)體對(duì)其敏感程度。方法及步驟:試驗(yàn)應(yīng)在哮喘緩解期進(jìn)行。試驗(yàn)前23天內(nèi)停用任何有關(guān)哮喘治療的藥物(包括2激動(dòng)劑、激素、茶堿、肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑等。常用的吸入過敏原包括各種花粉、霉菌、螨、室內(nèi)塵土等。一般以10倍的梯度配制溶液系列,將過敏原稀釋成濃度為1:100、1:1000、1

9、:10000、1:100000等。如估計(jì)在直接吸入下一濃度有可能誘發(fā)哮喘發(fā)作,則可在上述濃度系列中插入中間濃度的稀釋液如l:500、1: 5000等。一般最高吸入濃度,室內(nèi)塵土不超過1:10,花粉不超過1:100,霉菌不超過1:1000。試驗(yàn)開始時(shí)首先測(cè)定患者的基礎(chǔ)肺功能(FEV1或PEFR等。然后按照濃度從低到高的次序,分別給病人霧化吸入定量過敏原稀釋液。觀察患者反應(yīng)并在10分鐘后復(fù)查患者肺功能指標(biāo)。當(dāng)病人出現(xiàn)胸部緊迫感、喘息;肺部聞及哮鳴音;FEV、下降大于15%時(shí),表明該試驗(yàn)結(jié)果陽性,立即終止試驗(yàn)。若吸入最高濃度的稀釋液后仍無上述表現(xiàn),結(jié)果可判為陰性。在試驗(yàn)過程中應(yīng)注意:為避免支氣管哮喘

10、的嚴(yán)重發(fā)作,必須從最低濃度開始;由于遲發(fā)性反應(yīng)的存在,有條件者應(yīng)觀察24小時(shí)以上;在進(jìn)行多種過敏原的BPT時(shí),兩次激發(fā)試驗(yàn)應(yīng)間隔足夠長(zhǎng)時(shí)間,以免影響結(jié)果。近年來,Tamura等人提出應(yīng)用單次過敏原吸入法,從而簡(jiǎn)化了BPT的測(cè)定。該法的過敏原稀釋液只有一個(gè)濃度,室內(nèi)塵土為1:5,豚草為1:10,花粉為1:10,患者一次性霧化吸入過敏原稀釋液一分鐘后,連續(xù)測(cè)定其基礎(chǔ)呼吸阻力(Rrs 10分鐘,若10分鐘內(nèi)Rrs上升超過基礎(chǔ)值的35%,則為陽性反應(yīng)。BPT直接以支氣管粘膜作為靶器官,因而,對(duì)引起支氣管哮喘發(fā)作的過敏原及機(jī)體敏感狀態(tài)的判斷不僅直接,而且敏感、準(zhǔn)確。同一種待測(cè)過敏原,如果皮試結(jié)果與BPT

11、 結(jié)果相矛盾,則以BPT試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。但本法也存在著一些不足:引起敏感病人支氣管哮喘嚴(yán)重發(fā)作的危險(xiǎn)性較大;需要有專門的儀器和設(shè)備;每次激發(fā)只能采用一種過敏原,因而檢驗(yàn)效率低。同時(shí),我們還?？吹竭@樣的現(xiàn)象,有些病人對(duì)某一種過敏原的BPT呈陽性反應(yīng),但這些病人卻在同樣過敏原存在的場(chǎng)所或空間并不表現(xiàn)哮喘發(fā)作,或者只出現(xiàn)輕度的鼻部癥狀,即BPT試驗(yàn)也存在一定的假陽性率。鑒于以上不足,BPT在臨床上的應(yīng)用也受到一定的限制。目前國外多采用“自然暴露法”以降低假陽性率。2.眼激發(fā)試驗(yàn)(ophthalmic prococation test 方法及步驟:一側(cè)眼中滴入一滴濃度為1:1000的過敏原稀釋液,另一側(cè)

12、滴入一滴不含過敏原的過敏原溶媒作為對(duì)照,十五分鐘后觀察結(jié)果。若無反應(yīng),可在同側(cè)眼中滴入1:100的過敏原稀釋液,十五分鐘后仍無反應(yīng),則依次用1:10、純凈的過敏原粉末進(jìn)行試驗(yàn)。其陽性反應(yīng)表現(xiàn)為眼刺癢感、流淚、結(jié)膜充血水腫。由于受試部位在眼睛,故我們?cè)谠囼?yàn)中應(yīng)注意:觀察后,應(yīng)立即用生理鹽水或3%的硼酸溶液沖洗;反應(yīng)重的可滴入12滴腎上腺素或0.5%的醋酸可的松溶液。眼激發(fā)試驗(yàn)比較簡(jiǎn)單、直觀。但過敏原稀釋液、純凈的過敏原粉末對(duì)結(jié)膜的非特異性刺激作用,易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外,具有強(qiáng)刺激性的過敏原切不可采用此法。3.鼻粘膜激發(fā)試驗(yàn)( nasal provocation test 方法及步驟:用兩張0.

13、5cmx lcm大小的濾紙片浸滿過敏原原液或不含過敏原的過敏原溶解液(也可直接將過敏原粉末或淀粉分別置于兩側(cè)鼻甲的前端。如果五到十五分鐘內(nèi)出現(xiàn)鼻癢、鼻塞、噴嚏、流涕等癥狀,檢查可見接觸過敏原側(cè)鼻腔粘膜蒼白、水腫,鼻腔中有大量漿液性分泌物,表明該試驗(yàn)結(jié)果陽性。鼻粘膜激發(fā)試驗(yàn)的結(jié)果較為直觀、可靠,其與臨床相符率比皮試高,但該試驗(yàn)每次只能檢測(cè)一種抗原,檢驗(yàn)效率低。二、特異性IgE抗體的檢測(cè)隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,通過對(duì)抗原特異性IgE的檢測(cè)從而明確過敏原的方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。其中包括放射性變應(yīng)原吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)等。(一放射性變應(yīng)原吸附試驗(yàn)(radio all

14、ergosorbent test,RASTRAST于1967年,由Wide等人首次應(yīng)用于血清中特異性IgE的檢測(cè)。它的原理是:將待測(cè)過敏原結(jié)合于固相聚合體(纖維素顆?；?yàn)V紙等,聚合體上的過敏原與待測(cè)血清中特異性IgE結(jié)合,形成聚合體一過敏原.特異性IgE的復(fù)合物。當(dāng)加入用同位素標(biāo)記(常用125 I的抗IgE抗體后,進(jìn)一步結(jié)合形成聚合體.過敏原特異性IgE-125 I抗IgE抗體的大復(fù)合物。用-計(jì)數(shù)器測(cè)定整個(gè)大復(fù)合物的放射活性。待測(cè)血清中的特異性IgE的濃度與大復(fù)合物的放射性成正比。由此判斷待測(cè)血清中特異性lgE的水平。1.RAST的一般步驟用溴化氫技術(shù)將過敏原(如花粉、屋塵、螨等兩價(jià)結(jié)合于濾紙

15、片后,將濾紙片放入容器的底部,用微量加樣器小心將待測(cè)血清(或標(biāo)準(zhǔn)品加在濾紙上,室溫孵育至血清IgE(標(biāo)準(zhǔn)品與過敏原充分結(jié)合后,應(yīng)用磷酸緩沖液(PBS液多次沖洗容器及濾紙片,洗去未結(jié)合的IgE;加入125 I標(biāo)記的抗人IgE,室溫孵育后,再用磷酸緩沖液洗去未結(jié)合的碘標(biāo)記抗人IgE抗體;置于-計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):一般以大于正常人平均數(shù)加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差者為陽性。2.RAST的優(yōu)點(diǎn)結(jié)果準(zhǔn)確,RAST與過敏原皮試和支氣管粘膜激發(fā)試驗(yàn)等方法的檢測(cè)結(jié)果符合率高;可同時(shí)進(jìn)行多種過敏原和多個(gè)病人血清的檢測(cè);敏感度高、特異性好;不受所用平喘藥物的影響?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn),多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RAST是檢測(cè)血清特異性IgE 的

16、金標(biāo)準(zhǔn),成為抗原特異性IgE檢測(cè)的首選方法。目前已成為支氣管哮喘的病因?qū)W診斷和免疫治療療效的可靠指標(biāo)。3.RAST的缺點(diǎn)同皮試法相比,其敏感性稍低于皮試;易受到一些因素的干擾,如特異性IgG水平的增高可影響RAST的結(jié)果;需要采用-計(jì)數(shù)器、液體閃爍儀等專門儀器設(shè)備;采用放射性核素,易污染環(huán)境,需要一系列的同位素防護(hù)和處理措施。故不能廣泛開展。目前,國外多采用“Cap-system”使RAST檢測(cè)自動(dòng)化,并且使檢測(cè)結(jié)果更加敏感。Cap 是內(nèi)裝高度親水、具有一定彈性的載體的塑料帽狀物,該載體實(shí)質(zhì)上是一種纖維素的化學(xué)衍生物,具有纖維素的特性。但Cap同普通纖維素圓盤相比,它具有三維空間的立體結(jié)構(gòu)模式

17、,增加了載體的表面積,有利于過敏原的吸附和有利于過敏原同特異性IgE快速結(jié)合。其結(jié)合過敏原的量是相應(yīng)大小的纖維素圓盤的三倍,而且也將特異性IgE同過敏原結(jié)合達(dá)到平衡所需要的時(shí)間縮短為二十分鐘。此外,利用載體的彈性,可用自動(dòng)化擠壓的方法把未結(jié)合的物質(zhì)沖洗干凈,盡量減少了測(cè)量“本底”。目前,“Cap-system”多應(yīng)用-半乳糖苷酶( -galsctosidase分解底物4-甲基傘桂- -D半乳糖苷(4-methylumbelliferryi-p-falactoside產(chǎn)生熒光的原理,采用熒光酶聯(lián)法(RAST FEIA代替常用的放免法(RIA。這些改進(jìn)使“Cap-system”能對(duì)特異性IgE進(jìn)行

18、自動(dòng)化檢測(cè),而且更加敏感、特異、高效。鑒于RAST的不足之處,我們可以看到,RAST并不能夠代替病史的詢問和過敏原皮試。臨床研究結(jié)果也顯示皮試與臨床的符合率常常比RAST結(jié)果更為接近。世界衛(wèi)生組織(WHO在評(píng)價(jià)臨床免疫學(xué)八種廣泛使用的診斷方法的備忘錄中指出,在以下情況下考慮作RAST的檢測(cè):因皮膚劃痕征陽性或嚴(yán)重皮炎不能作皮試者;抗組胺等對(duì)癥治療藥物影響皮膚反應(yīng)者;皮試可能發(fā)生危險(xiǎn)者;不能用于皮試的變應(yīng)原,如毒素,非水溶性或高度致敏性物質(zhì);食物過敏,皮試結(jié)果不可靠者;皮試結(jié)果可疑者。(二酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)I enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA1976年

19、,Weltman應(yīng)用單抗體法,以半乳醇苷酶標(biāo)記的ELISA技術(shù)首次測(cè)定了血清中特異性的IgE抗體后,ELISA法測(cè)定血清特異性IgE的方法漸為人們所采用。其操作方法也已經(jīng)有了很大的改進(jìn)。ELISA的原理是:將過敏原吸附于聚苯乙烯小孔后,加入待測(cè)IgE,使過敏原與特異性IgE相結(jié)合,形成過敏原特異性IgE的復(fù)合物。再加入酶標(biāo)的抗人IgE抗體(常用辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AKP標(biāo)記形成過敏原特異性IgE-酶標(biāo)抗人'IgE的復(fù)合物。最后加入酶的底物(鄰苯二胺或4-硝基苯磷酸鹽酶解有色底物形成有色產(chǎn)物,根據(jù)顏色深淺測(cè)出特異性IgE的含量。ELISA的一般步驟:取潔凈聚苯乙烯凹空反應(yīng)板,

20、每孔加入含過敏原的包被緩沖液,置37濕盒中過夜,使過敏原充分吸附于反應(yīng)板;倒去包被液,用緩沖液洗去未結(jié)合的過敏原后,每孔內(nèi)加入待測(cè)血清和陰性參考血清,并設(shè)定空白對(duì)照,然后放置37濕盒2小時(shí),使過敏原與特異性IgE結(jié)合;洗去未結(jié)合的血清部分,每孔加入稀釋的抗人IgE酶標(biāo)抗體(如辣根過氧化物酶,再置之濕盒孵育形成三重復(fù)合物;洗去未結(jié)合部分,每孔加入底物溶液,反應(yīng)一段時(shí)間后,每孔內(nèi)加入抑制劑終止酶反應(yīng);酶標(biāo)光度計(jì)在一定波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度值;計(jì)算結(jié)果,以待測(cè)血清和陰性對(duì)照血清的光密度比值( P/N來表示特異性IgE水平,以P/N2.1為陽性。同RAST相比,ELISA具有簡(jiǎn)便、快速、安全的優(yōu)點(diǎn),而且價(jià)

21、格便宜,可避免接觸同位素;同時(shí),酶標(biāo)抗體相對(duì)穩(wěn)定,可以長(zhǎng)期保存;在準(zhǔn)確性方面,ELISA同RAST、BPT、過敏原皮試結(jié)果有符合率高,故而目前在國內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。在ELISA的基礎(chǔ)上,Hawkes等人于1982年利用硝酸纖維膜能夠吸附蛋白質(zhì)、核酸的特性,刨建了點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)(DOT ELISA.使ELISA的操作更為簡(jiǎn)單,現(xiàn)將具體方法介紹如下:將硝酸纖維素膜在TBS緩沖液(50mmol/L Tris-Hcl, 150mmol/LNacl,pH7,6中浸泡10分鐘后用濾紙吸干水分;將硝酸纖維素膜切成小條,每隔一定距離(5mm加入過敏原溶液2ul,每種過敏原做2個(gè)點(diǎn),滲入后,置溫箱,使其完全吸

22、附;TBS液沖洗數(shù)次后,將膜條置入一多槽盤中,每槽一條,各自加入稀釋的血清,室溫反應(yīng)過夜;洗滌后,各槽加入稀釋有酶標(biāo)(HRP標(biāo)記抗人IgE抗體,室溫?fù)u動(dòng)一個(gè)半小時(shí);洗滌后各槽加入底物溶液(可用3mg/ml的4-氯-l-萘酚甲醇貯存液0.6ml+ 5mLTBS液+2130%的H2 02,反應(yīng)一段時(shí)間后用蒸餾水漂洗纖維膜,直至背景清晰;判斷結(jié)果,以出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)為陽性。DOT ELISA檢測(cè)抗原特異性IgE,其結(jié)果與ELISA基本符合,符合率達(dá)85%以上。該方法與皮試結(jié)果的符合率也較高。該方法與ELISA法相比,不需要特別儀器,抗原膜可以長(zhǎng)期保存,還可同時(shí)檢測(cè)多種抗原特異性IgE抗體。三、嗜堿性粒細(xì)

23、胞釋放能力的體外檢測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞釋放能力( human basophil releasability,HBR是指嗜堿性粒細(xì)胞在應(yīng)答各種刺激時(shí)釋放化學(xué)介質(zhì)(脫顆粒的能力。眾所周知,支氣管哮喘的發(fā)作與否,并非直接取決于循環(huán)中IgE抗體水平,而是取決于已致敏的嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞在各種特異性和非特異刺激下釋放化學(xué)介質(zhì)(脫顆粒的能力。研究表明,哮喘病人血中嗜堿性粒細(xì)胞對(duì)各種特異性的免疫刺激(過敏原和非特異性的免疫刺激(抗IgE抗體的反應(yīng)性同哮喘發(fā)作的嚴(yán)重性呈平行關(guān)系。因而嗜堿性粒細(xì)胞釋放能力的檢測(cè)越來越受到人們的重視,現(xiàn)已成為人們尋找過敏原、預(yù)示病情和判斷療效的常用方法。它的檢測(cè)方法主要有兩種,嗜堿

24、性粒細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)和人嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)。(一嗜堿細(xì)胞組胺釋放試驗(yàn)(histatnine release from besophil test,HRBT HRBT是由Lichtenstein于1964年首先建立。其原理:人血中的組胺幾乎全部存在于嗜堿性粒細(xì)胞中。哮喘病人的嗜堿性粒細(xì)胞在體外與相應(yīng)過敏原孵育時(shí),過敏原披嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE所識(shí)別,產(chǎn)生橋聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致胞漿顆粒釋放,從而使組胺也得到了釋放,應(yīng)用熒光法或同位素酶法測(cè)定組胺的水平能夠反映出患者對(duì)某種過敏原是否敏感以及機(jī)體的敏感程度。其具體的操作方法有兩種:洗滌白細(xì)胞法和全血法?，F(xiàn)介紹如下:1 洗滌白細(xì)胞法(1制備白細(xì)胞懸液:用硅

25、油處理的無菌注射器采集lOml靜脈血,肝素化后加入3%葡萄糖3%葡聚糖溶液2ml,混勻,靜置6090分鐘,直至紅細(xì)胞和血漿層之聞出現(xiàn)明顯分層。小心吸出血漿和白細(xì)胞層,離心后棄上清。用Tris-A緩沖液沖洗白細(xì)胞兩次,最后用含鈣、鎂離子的Tris-ACM緩沖液將其稀釋成3×105個(gè)白細(xì)胞懸液。(2孵育:細(xì)胞懸液中加入待測(cè)過敏原,并在37條件下孵育60分鐘后,離心,取上清液備測(cè)。(3組胺的檢測(cè):采用熒光法檢測(cè),應(yīng)用正丁醇溶液提取上清中的組胺,接著用正庚烷的鹽酸溶液提出組胺,然后在堿性條件下,加入苯二甲醛,產(chǎn)生帶熒光的縮合物,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定,并計(jì)算組胺釋放率:組胺釋放率%=(過敏原管

26、一對(duì)照管÷(總細(xì)胞管一試劑空白管×100%組胺釋放率大于15%為陽性。2.全血法直接將過敏原加入肝素化全血中進(jìn)行組胺釋放試驗(yàn),可以更好地反映機(jī)體反應(yīng)狀態(tài),同時(shí)還具有用血量少和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。HRBT可用于評(píng)價(jià)機(jī)體的過敏反應(yīng),HRBT狀態(tài)的結(jié)果與過敏性哮喘病人的臨床癥狀、過敏原皮試及血清特異性IgE抗體水平有顯著的相關(guān)性;還可以測(cè)定IgE抗體活性及檢測(cè)嗜堿性粒細(xì)胞表面特異性的IgE抗體;此外也可測(cè)定特異性IgG和脫敏療法對(duì)此抗體的影響。HBRT的敏感度高,結(jié)果可靠,但所需儀器設(shè)備要求高,影響因素也比較多,故目前較多采用人嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)。(二人嗜堿細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)(hum

27、an basophil degranulation test,HBDTHBDT利用嗜堿性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)硫酸肝素顆?？杀患妆桨匪{(lán)和阿利新藍(lán)等堿性染料染色的原理,在加入過敏原后,過敏原與吸附與嗜堿性粒細(xì)胞表面的特異性IgE結(jié)合,產(chǎn)生橋聯(lián)反應(yīng),可導(dǎo)致嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒,從而使被染色的細(xì)胞減少。因而,可以通過測(cè)定管與對(duì)照管中的被染色的嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)值的對(duì)比;來了解過敏原及機(jī)體過敏狀況。HBDT的一般步驟:先制備細(xì)胞懸液,取肝素抗凝血3ml與等量pH7.6HepesACM 緩沖液混合,平鋪于3ml葡聚糖一泛影葡胺分離液面后,離心,用滴管輕輕吸取中間層細(xì)胞,置于含5ml同樣緩沖液的試管中,充分混勻后離心,

28、棄上清,留0.3ml懸液混勻;孵育。用微量加樣器分別吸取不同濃度的過敏原溶液加入各試管中,再加入已制備的細(xì)胞懸液混勻;將細(xì)胞一過敏原混合液置37水浴,然后用阿利新藍(lán)( Alcianblue染色后,滴入計(jì)數(shù)板,數(shù)兩個(gè)九大格嗜堿性粒細(xì)胞數(shù),取均值計(jì)算脫顆粒指數(shù)(Degranulation index, DI:DI=(對(duì)照管嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)一測(cè)定管嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)÷對(duì)照管嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)×100%DI> 30%為陽性。HBDT可用于過敏原的檢測(cè)和哮喘發(fā)病機(jī)制的研究。同HBRT相比,具有設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、易于在基層醫(yī)院開展的優(yōu)點(diǎn)。但本法不適用于少數(shù)外周血嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)少

29、于20個(gè)/l的病人。第二節(jié)非特異性免疫學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)一、血清中總IgE的檢測(cè)本試驗(yàn)主要檢測(cè)血清中的總IgE水平。IgE是支氣管哮喘發(fā)病有關(guān)的重要的免疫球蛋白。支氣管哮喘病人血清中的總IgE常有升高,血清中的總IgE水平的升高也預(yù)示了受試者患有支氣管哮喘等特應(yīng)性疾病。目前,檢測(cè)血清IgE的常用方法包括紙片放射免疫吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫法、反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)、放免吸附技術(shù)、放射單擴(kuò)散技術(shù)等。(一紙片免疫吸附試驗(yàn)( paper radioimmunosorbent test,PRIST國外多采用此法檢測(cè)血清中的總IgE。1.原理及步驟(1將抗IgE抗體偶聯(lián)于經(jīng)溴化氫活化的濾紙片上;(2加入待測(cè)標(biāo)本或IgG標(biāo)準(zhǔn)

30、品,形成抗IgE - IgE的復(fù)合物;(3加入125I標(biāo)記的抗IgE抗體,形成抗IgE-lgE-125I_抗IgE復(fù)合物;(4測(cè)定復(fù)合物的放射性活度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定代測(cè)血清中總IgE的水平。2評(píng)價(jià)PRIST具有靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),但需要-計(jì)數(shù)器或液體閃爍儀等檢測(cè)設(shè)備,費(fèi)用高,并需要一定的同位數(shù)防護(hù)和處理措施,因此在國內(nèi)臨床應(yīng)用受到很大的限制。(二酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linded immunosorbent assay.ELISAELISA測(cè)血清總IgE在國內(nèi)應(yīng)用較為廣泛。目前經(jīng)常采用雙抗體法。1.原理及步驟(1將抗人IgE包被于聚苯乙烯微量測(cè)定凹空板中;(2加入待測(cè)血清樣品

31、或標(biāo)準(zhǔn)品與之相結(jié)合,形成抗人IgE -IgE復(fù)合物;(3加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE抗體,形成抗人IgE - lgE-酶標(biāo)抗人IgE復(fù)合物;(4洗去菲結(jié)合部分后,加入酶的底物鄰苯二胺或4-硝基苯磷酸鹽;(5根據(jù)酶解底物呈現(xiàn)的顏色反應(yīng),應(yīng)用微量分光光度計(jì)測(cè)定光密度值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)血清總lgE的量。2.評(píng)價(jià)ELISA法具有特異、敏感、迅速、簡(jiǎn)單、易于開展的優(yōu)點(diǎn)。但仍需要一定的檢測(cè)儀器、費(fèi)用也較高。(三反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)(rerersed passive hemmmogglutination test,RPHAT是一種半定量的血清總IgE測(cè)定方法。1.原理及步驟應(yīng)用戊二醛或甲

32、醛固定綿羊紅細(xì)胞;將抗人IgE結(jié)合于綿羊紅細(xì)胞使之成為“致敏紅細(xì)胞”;對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行二倍法稀釋,然后分別在各管中加入“致敏紅細(xì)胞”;觀察不同血清濃度試管中紅細(xì)胞的凝集情況,從而了解總IgE的水平。2.評(píng)價(jià)RPHAT法不需要特別儀器、操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn),能夠在我國廣大基層醫(yī)院開展應(yīng)用。但其敏感性較ELISA法和PRIST法稍低。(四放射單擴(kuò)散法(radioactive single radical diffusdion technique,RSRD和放射免疫吸附技術(shù)( radio immunosorbent technique.RIST前者操作復(fù)雜、敏感性低,而后者國內(nèi)缺少必要的試劑,因

33、兩者在國內(nèi)很少應(yīng)用故不再贅述。二、嗜酸性粒細(xì)胞及其介質(zhì)的檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞是支氣管哮喘發(fā)病過程中的重要細(xì)胞,它在哮喘的遲發(fā)性的反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。早已明確,支氣管哮喘患者支氣管肺泡灌洗液和痰液中,嗜酸性粒細(xì)胞明顯升高,而對(duì)于具有雙相哮喘反應(yīng)者同時(shí)還伴有血嗜酸性粒細(xì)胞的升高。故而,嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)成為支氣管哮喘免疫學(xué)診斷的一個(gè)重要方面。(一血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)利用嗜酸性粒細(xì)胞中的顆粒的染色反應(yīng)進(jìn)行計(jì)數(shù)細(xì)胞,常用的染色液有伊紅甲醛稀釋液、伊紅甘油稀釋液及伊紅一丙酮稀釋液三種。其一般步驟為:吸取稀釋液0. 38ml 加入試管內(nèi);用毛細(xì)取血管吸取末梢血液20L加入該試管內(nèi),輕輕混勻,靜置五分鐘;用滴管吸取少量樣品滴入Fuchs-Rlsenthal血球計(jì)數(shù)池內(nèi),用低倍鏡觀察10個(gè)大方格內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(嗜酸性粒細(xì)胞被染成桔紅色;計(jì)算,嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)/L= 10個(gè)大方格內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)×20×106,正常值為(0.050.3×l09/L。(二痰液的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)痰液是來源于氣道表面的粘液,因而對(duì)痰液嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)能夠反映氣道的嗜酸性粒細(xì)胞的炎癥情況。其方法及步驟如下:用棉簽蘸取或用小的金屬鉤和剪刀切取痰塊的一小部分,涂f載玻片上;滴加等體積的leishma