免疫學作業(yè)-食品的免疫學檢測方法

1、食品的免疫學檢測方法免疫學檢測方法是應用免疫學理論設計的一系列測定抗原、抗體、免疫細胞及其分泌的細胞因子的實驗方法,其基本原理是抗原抗體反應?？乖贵w反應是指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結合反應。隨著學科間的相互滲透，免疫學涉及的范圍不斷擴大，新的免疫學檢測方法層出不窮。免疫學方法的應用范圍亦在日益擴大，不僅成為多種臨床疾病診斷的重要方法，也為眾多學科的研究提供了方便。免疫學檢測技術是食品檢測技術中的一個重要組成部分，特別是三大免疫技術熒光免疫技術、酶免疫技術和放射免疫技術在食品檢測中得到了廣泛應用。利用免疫學檢測技術可檢測細菌、病毒、真菌、各種毒素、寄生蟲等，還可用于蛋白質(zhì)、激素、其他生

2、理活性物質(zhì)、藥物殘留、抗生素等的檢測，其檢測方法簡便、快速、靈敏度高、特異性強，特別是單克隆抗體的發(fā)展，使得免疫檢測方法特異性更強，結果更準確。一、 免疫熒光技術免疫熒光技術是一種將免疫反應的特異性與熒光標記分子的可見性結合起來的方法。在一定條件下，用化學方法將熒光物質(zhì) （熒光素）與抗體結合，但不影響抗體與抗原結合的活性，與相應抗原結合后，在熒光顯微鏡下觀察抗原的存在與部位，可定位，亦可用熒光計定量。但熒光標記信號較弱，因而檢測靈敏度不是很高。免疫熒光分析(Immuno Fluorescence Assay,IFA)始創(chuàng)于20世紀40年代初，1942年Cons等首次報道用異硫氰酸熒光素標記抗體

3、，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗體，但此種熒光素標記物的性能較差，未能推廣應用。20世紀50年代，Riggs等合成性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光素。Mashall等對熒光抗體的標記方法又進行了改進，從而使得免疫熒光技術逐漸推廣應用。免疫熒光技術在實際應用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清,經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。免疫熒光直接法可清楚地觀察抗原并用于定位標記觀察。間接法是在檢測樣品上滴加已知的細菌特異性抗體,待作用后經(jīng)洗滌,再加入熒光標記的第二抗體。1底物標記熒光測定法底物標記熒光測定法(SLFIA)使用一種酶的底物標記待測物，底物本身無

4、熒光，在受到相應酶的催化時能轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒馕?，當標記底物與抗體結合產(chǎn)生的空間位阻阻礙了酶與標記底物間的接觸，樣品中的待測物通過競爭作用使游離的酶標結合物或熒光強度增加。2熒光偏振免疫測定法使用偏振光作為激發(fā)光時，視分子的運動狀態(tài)，發(fā)射的熒光可能是振動方向隨機化的普通熒光，或是只在某一平面振動的偏振熒光(ploarized fluorescence)。在反應液中，游離的標記物分子體積小，在布朗運動中轉(zhuǎn)動速度快，受偏振光照射后產(chǎn)生的熒光偏振方向被分散，不能產(chǎn)生偏振光，只發(fā)射普通熒光；與抗體結合的標記物分子體積增大，布朗運動速度減慢，甚至不能轉(zhuǎn)動而形成定向排列，所以受偏振光激發(fā)后能產(chǎn)生偏振熒光，樣品中的

5、待測物的量越大，偏振熒光的強度越高。1.熒光淬滅免疫測定法熒光淬滅免疫測定法(Fluoresecent QuenchingImmunoassay)的原理是當熒光標記物與抗體結合后發(fā)生熒光淬滅。熒光猝滅的機制尚不清楚，熒光淬滅可能與標記物與抗體結合后導致電子振動狀態(tài)的改變有關。3熒光增強免疫測定法熒光增強免疫測定法(Fluoresecent EnhancementImmunoassay)的原理與熒光淬滅增強免疫測定法相似，不同的是標記物與抗體結合后熒光強度增強。二、酶免疫檢測技術酶免疫檢測技術是20世紀60年代在熒光和組織化學的基礎上發(fā)展起來的一種新技術，最初用酶代表熒光素標記抗體作為生物組織中

6、抗原的鑒定和定位。隨后發(fā)展為用于鑒定免疫擴散及免疫電泳板上的沉淀線。到1971年，Engrall等用堿性磷酸酶標記抗原或抗體，建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，這一技術因其高度的準確性、特異性、應用范圍廣、檢測速度快以及費用低等優(yōu)點，是目前食品檢測中令人矚目的有發(fā)展前途的一種新技術。酶免疫技術發(fā)展迅猛，種類繁多，酶免疫技術分為酶免疫組化技術和酶免疫測定技術，酶免疫測定技術又分為均相免疫測定技術和異相免疫測定技術，異相免疫測定技術又分為固相免疫測定技術和液相免疫測定技術。固相免疫測定法的代表技術是酶聯(lián)免疫吸附技術（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA

7、）。它食品安全檢驗中最為廣泛應用的方法之一。ELISA是以免疫學反應為基礎,將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種高靈敏度的檢測技術。ELISA技術結合了免疫熒光法和放射免疫測定法兩種技術的優(yōu)點,具有可定量、反應靈敏準確、標記物穩(wěn)定、適用范圍寬、結果判斷客觀、簡便完全、檢測速度快以及費用低等特點,且同時可進行上千份樣品的分析。但ELISA的分類至今尚無統(tǒng)一的標準。隨著該技術在檢測分析領域的廣泛應用,有些學者根據(jù)有關的文獻及試劑的來源、標本的情況和檢測的具體條件,提出以下幾種常用的測定方法:(a)測定抗體的間接法;(b)測定抗原的雙抗體夾心法;(c)測定抗原的競爭法;(

8、d)測IgM抗體的捕獲法;(e)ABS(avidin biotin system)-ELISA法;(f)PCR-ELISA法;(g)斑點免疫酶結合試驗(DIA)等。ELISA分析與其它方法相比,有以下優(yōu)勢:高特異性;高靈敏性,檢測范圍在ng和pg水平;準確度高、重現(xiàn)性好;一次性可處理大量樣品,適宜于用定性試驗進行篩選;易于推廣到基層。ELISA分析也存在著一些缺陷,比如:不能同時分析多種成分;對試劑的選擇性高；對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應。但如果與其它檢測手段聯(lián)合使用，如GC、HPLC,既可增加檢測的靈敏度又可降低交叉反應，還可進行更準確的定量。三、放射免疫技術放射免疫技術(Radi

9、oImmunoassay，RIA)是一種以放射性同位素作為標記物，將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反應的特異性這兩大特點結合起來的檢測技術。是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的標記免疫分析技術。由于標記物放射性核素的檢測靈敏性，本法靈敏度高，測定準確性良好，特別適應于蛋白質(zhì)、激素和多肽的精確定量測定。但需特殊儀器及防護措施，并受同位素半衰期的限制。RIA測定就是應用放射性物質(zhì)代替ELISA中的標記酶作為抗原或抗體耦聯(lián)物，在食品安全檢測中最常見的同位素是3H和14C。1981年，放射免疫分析法(RIA)首先用于檢測人的血液和萵苣葉片上的對硫磷殘留量,檢測限為1020 ng/mL，檢測水中

10、的殘留量可達4 ng/mL。1978年，Charm在RIA技術的基礎上發(fā)展了放射免疫檢測技術(RRA)，放射免疫檢測在快速檢測方面最成功的是Charm6600/7600抗生素快速檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)就是利用專一受體來識別結合于同一類抗生素族中的母環(huán)以便最快速同時檢測同一抗生素族在樣品中的殘留情況。目前，Charm7600檢測系統(tǒng)就內(nèi)酰胺類、氯霉素類、四環(huán)素類、磺胺類、氨唑西林及堿性磷酸酶這六項檢測以被FDA認可。1986年，Evrard P.等對牛尿提取、濃縮后，利用放射免疫法(RIA)對其中殘留的諾龍進行了檢測，其靈敏度是6 pg/mL，IC50值為59 pg/mL。通過對免疫原的設計，使得這種

11、方法對其代謝產(chǎn)物19-NA、19-NE等也有較高的交叉反應，具有較高的檢出率。放射免疫技術由于可以避免假陽性，適宜于陽性率較低的大量樣品檢測，對水產(chǎn)品、肉類產(chǎn)品、果疏產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量的檢測中廣泛應用。還可檢測經(jīng)食品傳播的細菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲及小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)。四、免疫膠體金檢測技術免疫膠體金檢測技術又叫Rosa.Tests法，是以膠體金作為示蹤標志物,應用于抗原抗體反應中的一種新型免疫標記技術。膠體金(Colloidal gold)是由氯金酸(HAuCl4)水溶液在還原劑作用下,聚合成特定大小的金顆粒,顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),也稱金溶膠(goldsol

12、)。其特點是根據(jù)需要可制備大小不同的金顆粒(直徑在1150nm之間)顏色呈桔紅色到紫紅色，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結合，且不影響其生物活性。1962年Feldherr第一次介紹了膠體金可作為一種電子顯微鏡水平的示蹤標記物。Faulk（1971）把膠體金引入免疫化學，這一年被公認是免疫膠體金技術誕生的一年。近年來，研究人員根據(jù)膠體金的物化性質(zhì)進一步拓展基于金標記的生物檢測技術及膠體金在其他生物學方面的應用。該技術當前主要用于在牛奶中檢測抗生素，可在10min內(nèi)快速檢測牛奶中的抗生素，利用該技術可檢測的抗生素種類有六種，內(nèi)酰胺、四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星和黃曲霉毒

13、素，可檢測的內(nèi)酰胺藥物有氨芐青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素頭孢噻呋、頭孢霉素和青霉素G等。免疫膠體金檢測技術結果直觀、操作簡單，在食品安全檢測中有廣闊的應用前景。膠體金免疫層析技術相對于其他的檢測方法有其固有的優(yōu)點：低聚合：金標液中單態(tài)的占85%以上，沒有三個以上的聚合高清晰度：由于金粒的不連續(xù)性、抗體/結合蛋白質(zhì)緊密吸附于表面，抗原定位非常清晰；保存期限長。膠體金免疫層析技術也有其缺點：操作過程要求嚴格，器皿要求相當潔凈；保藏時要求干燥環(huán)境；交叉反應。五、單克隆抗體技術1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成了雜交細胞即可產(chǎn)生抗體

14、，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術為醫(yī)學和生物學基礎研究開創(chuàng)了新紀元，是免疫學領域的重大突破。單克隆抗體在食品檢測中最大的優(yōu)點是特異性強，不易出現(xiàn)假陽性。在食品檢測中有廣泛的應用前景。目前人們已制備出各種經(jīng)食品傳播和引起食物中毒的細菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生蟲、農(nóng)藥、獸藥、激素等的單克隆抗體并建立的檢測方法。Shirazid等采用戊二醛，青霉素化反應等不同的免疫原合成方法，免疫小鼠，篩選出單克隆抗體檢測牛奶和畜產(chǎn)品中-內(nèi)酰胺類抗生素殘留，最低檢測限度為2.55 ng/mL。吳建祥用與細胞色素C交聯(lián)的氨芐青霉素(Amp-Cy)免疫的BALB/c鼠脾細胞與SP2/0鼠骨

15、髓瘤細胞融合，經(jīng)篩選、克隆，獲得3株能穩(wěn)定傳代并分泌抗青霉素的單克隆抗體的雜交瘤細胞，間接競爭酶附試驗(CI-ELISA)顯示，3株單克隆抗體對青霉素類和先鋒霉素類抗生素有特異性反應，而對鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、土霉素、四環(huán)素、新霉素其他抗生素沒有交叉反應，可用于青霉素類抗生素殘留的檢測。磺胺二甲嘧啶和克倫特羅(瘦肉精)這兩種藥物被歐美各國和我國列為獸藥殘留控制重點，國內(nèi)研究出了用于動物性食品中磺胺二甲嘧啶檢測的單克隆抗體試劑盒和克倫特羅殘留檢測的多克隆試劑盒。這兩種試劑盒具有特異性強、儀器化程度低、樣品前處理簡單、檢測時間短，在實際生產(chǎn)中應用前景廣闊，填補了國內(nèi)空白。單克隆抗體檢測技術可在

16、10 min內(nèi)快速檢測有機磷類、氨基甲酸酯類、有機氯類、擬除蟲菊酯類及激素類的殘留量為農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)安全提供技術支持。英國建立了自動肉制品中的沙門氏菌的單克隆抗體檢測方法，人們還制出了單核增生性李特氏桿菌的單抗，用單抗ELISA檢測該菌。乳中氯霉素的單克隆抗體檢測技術也被建立。食品儲藏過程中會受到霉菌污染，現(xiàn)已從青霉、毛霉等霉菌中提取耐熱性抗原制成單克隆抗體用ELISA方法可檢出加熱和未加熱食品中的霉菌。六、免疫印跡技術(Western blotting)Western blotting是檢測特異性目的蛋白質(zhì)的定性方法,它可確定一個樣品中是否含有低于或超過預定限值水平的目的蛋白質(zhì),特別用于不溶性

17、蛋白質(zhì)的分析。其原理是先通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)區(qū)分樣品中不同的組分,并轉(zhuǎn)移至固相支持物(如硝酸纖維膜),再加入相應的抗體起免疫反應,最后加入標記二抗進行雜交、顯色,檢測樣品中是否含目的蛋白成分。免疫印跡(Western blotting)法分三個步驟:第一,聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將蛋白質(zhì)抗原按分子大小和所帶電荷的不同分成不同的區(qū)帶。第二,電轉(zhuǎn)移。目的是將凝膠中己分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。第三,酶免疫定位,該步的意義是將前兩步中已分離,但肉眼不能見到的抗原帶顯示出來。將印有蛋白抗原條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標記的第二抗體反應后,再與

18、能形成不溶性顯色物的酶反應底物作用,最終使區(qū)帶染色。免疫印跡法結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等特點,具有高靈敏度與高特異性的優(yōu)點。特別是對于那些不溶于去污劑裂解液的抗原,或者是難以標記、容易降解的抗原,均可采用該方法進行分析。但此法也存在一些不足之處,如難以定量、操作較繁瑣、花費時間長和不能同時檢測大量樣品等,這些缺點限制了其在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測上的應用。目前廣泛應用于酵母和真菌的檢測中。七、免疫PCR法多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)又稱體外核酸擴增技術，免疫PCR是利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性而建立的一種微量檢

19、測技術。其基本原理和常規(guī)標記免疫技術相似,只不過免疫PCR中所用的抗原或抗體標記物為DNA,在固相免疫結合反應完成后,再通過PCR技術對標記DNA進行擴增,最后通過檢測PCR產(chǎn)物對抗原或抗體進行定性或定量分析。在理論上免疫PCR可以檢測到一個分子抗原,因此免疫PCR特別適用于檢測一些含量特別少的抗原分子。目前已有用免疫PCR技術檢測抗HBC抗體、抗HAV抗體和抗HCV抗體等報道,均表明免疫PCR法靈敏度明顯高于ELISA。在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中,傳統(tǒng)的免疫檢測方法其靈敏度均有限,若將免疫PCR技術應用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中,將大大提高其靈敏度。當然,免疫PCR技術目前尚處于研究階段,其配套試劑尚缺乏,

20、所以應用的還不多,在報道的幾種方法中均是用一些已知的標準品進行試驗。因此,探索免疫PCR最佳反應條件,簡化步驟,實現(xiàn)標準化對于其推廣應用至關重要。八、發(fā)光免疫測定法(CLIA)發(fā)光免疫測定法常用魯米諾(Luminol)、異魯米諾(Isolumi-nol)及其衍生物進行標記。這些環(huán)肼類化合物在堿性條件下可被氧化產(chǎn)生3-胺基苯二甲酸鹽和430 nm的發(fā)射光。在魯米諾的芳氨基上進行烴鏈取代后產(chǎn)光性能增強，但若置換芳氨基則發(fā)光被破壞。另外丫叮酯也用于發(fā)光標記。化學發(fā)光免疫分析是將靈敏的化學發(fā)光或生物發(fā)光體系與特異的抗原抗體免疫測定結合于一體的檢測技術，化學發(fā)光免疫分析包含兩個部分,即免疫反應系統(tǒng)和化學

21、發(fā)光分析系統(tǒng)?；瘜W發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個激發(fā)態(tài)的中間體,當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時,同時發(fā)射出光子(hM),利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。免疫反應系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標記在抗原(化學發(fā)光免疫分析)或抗體(免疫化學發(fā)光分析)上,或酶作用于發(fā)光底物。CLIA操作簡單、靈敏度高、測定速度快。但CLIA產(chǎn)光物質(zhì)發(fā)光時間極短(數(shù)秒鐘)，測定誤差較大。與ELISA檢測方法相比，化學發(fā)光更靈敏，更為準確但化學發(fā)光需要借助發(fā)光儀。九、免疫層析技術免疫層析(immunochromatography,IC)是20世紀80

22、年代初發(fā)展起來的快速免疫分析技術,它將免疫學原理和層析原理相結合,借助毛細管的作用,樣品在條狀纖維制成的膜上泳動,其中的待測物與膜上一定區(qū)域的配體結合,通過酶促顯色反應或直接使用著色標記物,在短時間(20min內(nèi))便可得到直觀的結果。免疫層析按其原理可分為兩類,一類以酶促反應顯色為基礎,以顯色高度來定量;另一類則使用著色標記物如乳膠顆粒、膠體硒、膠體金以及脂質(zhì)體等。層析時,標記物與待測物被相應的配體捕獲而凝集顯色,以纖維膜上顯色條的有無或多少來定性或定量。 利用免疫層析原理開發(fā)出的各種食品微生物檢測試紙條具有很好的應用價值。十、其他免疫檢測技術隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類的不斷增加以及轉(zhuǎn)基因監(jiān)測制度的日

23、漸完善,過去所建立的免疫學檢測方法可能難以適應未來的發(fā)展需要,一些靈敏度更高、容易實現(xiàn)自動化的檢測方法可能是今后轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品免疫學檢測的研究方向。1脂質(zhì)體免疫測定法(LIA)脂質(zhì)體免疫測定法是一種較新的免疫測定技術，脂質(zhì)體是由磷脂或由其他類脂分子在水相中自發(fā)形成的一種密閉的雙分子單層或多層囊泡，脂質(zhì)體表面還可以連接抗原或抗體分子。這種生物模擬膜在形成過程中能包裹水及其中的溶質(zhì)(染料或酶)，膜的穩(wěn)定性可隨免疫反應有規(guī)律變化。根據(jù)釋放出的標記物的量進行測定，所以LIA具有很高的信號放大作用。目前LIA主要存在脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和非特異性溶解問題。2克隆酶給予體免疫測定法(CEDIA)克隆酶給予體免疫測定法是一種新型均