高速逆流色譜法

1、高速逆流色譜法高速逆流色譜法一、概述逆流色譜逆流色譜（countercurrent chromatography, CCC） 是一種簡單的液-液分配色譜技術，不用固體支撐體來保留固定相，避免了樣品的不可逆吸附、失活和變性等問題，近年來逐步發(fā)展成為一種備受關注的新型色譜分離技術。廣義定義：任何利用兩相不混溶液體的色譜技術；其中一相以一種相對均勻的方式縱向分布在一根空管或一系列的腔體中； 固定相固定相同時另一相以一定的速度通過第一相并與之混合。 流動相流動相減少了溶質分子與固體支撐體之間各種復雜的相互作用；不僅可以獲得高純度的分離組分；同時具有較高的回收率和重現性。逆流色譜的發(fā)展20世紀50年代，

2、逆流分溶法逆流分溶法（CCD）被廣泛用于天然產物的分離。有設備龐大復雜、溶劑消耗大、分離時間太長等缺陷。20世紀70年代，液滴逆流色譜液滴逆流色譜（DCCC）利用重力場將固定相保留在管形柱中，使流動相以液滴形式通過固定相。缺陷是分離時間長，溶劑體系有限。改進后的離心分配色譜離心分配色譜和螺旋管式逆流色譜螺旋管式逆流色譜，利用離心力場來實現固定相的保留，縮短了分離時間。20世紀70-80年代，高速逆流色譜高速逆流色譜(high-speed CCC, HSCCC)被研制。利用螺旋管的特殊同步行星式運動模式，短時間內實現高效分離。1993-1994年間，pH-pH-區(qū)帶精制逆流色譜技術區(qū)帶精制逆流色

3、譜技術發(fā)展起來，成功用于有機酸和有機堿的分離。1998年，Ito研究得到離心沉淀色譜離心沉淀色譜，為生物大分子以及細胞等生物物質分離開辟渠道。2002年，螺線形圓盤柱式高速逆流色譜螺線形圓盤柱式高速逆流色譜，改善保留。高速逆流色譜（高速逆流色譜（HSCCCHSCCC）High-speed countercurrent chromatography建立在一種特殊的流體動力學平衡基礎上，利用螺旋管的高速行星式運動產生的不對稱離心力場，實現兩相溶劑體系的充分保留和有效混合及分配，從而實現物質在兩相溶劑中高效分離。二、基本原理現代逆流色譜儀器體系：流體靜力學平衡體系流體靜力學平衡體系流體動力學平衡體系

4、（流體動力學平衡體系（HSCCCHSCCC體系）體系）儀器的兩個特征特征：a 有一個或多個纏繞有多層聚四氟乙烯管的線軸；b 沒有旋轉密封接頭，有一個安裝有兩個旋轉軸的齒輪傳動裝置，能產生一個可變的離心力場。 通過公轉、自轉（同步行星式運動）產生的二維力場，保留兩相中的其中一相作為固定相；離心力場的強度和方向都可以變化；傾析和混合交替出現，兩相液體在螺旋管柱中總是處在接觸狀態(tài)，沒有死體積存在；流體動力學CCC中壓力小，固定相保留值大。高速逆流色譜法是建立在單向性流體動力平衡體系單向性流體動力平衡體系之上的一種逆流色譜分離方法，它是在研究旋轉管的流體動力平衡時偶然發(fā)現的。當螺旋管在高速轉動時，螺旋

5、管中的兩相都從一端分布到另一端。用某一相作移動相從一端向另一端洗脫時，另一相在螺旋管里的保留值大約50%，但這一保留量會隨著移動相流速的增大而減小，使分離效率降低。但使螺旋管的轉速加快時，兩相的分布發(fā)生變化。當轉速達到臨界范圍時，兩相就會沿螺旋管長度完全分開，其中一相全部占據首端的一段，稱這一相為首端相，另一段全部占據尾端的一段，稱為尾端相。高速逆流色譜正是利用了兩相的這種單向性分布特征，在高的螺旋管轉動速高的螺旋管轉動速下，如果從尾端送入首端相，它將穿過尾端相而移向首端，同樣，如果從首端相送入尾相，它將穿過首端相而移向螺旋管的尾端。分離時，在螺旋管內首先注入其中的一相(固定相)，然后從合適的

6、一端泵入移動相，讓它載著樣品在螺旋管中無限次的分配。儀器轉速越快，固定相保留越多，分離效果越好，且大大地提高了分離速度，故稱高速逆流色譜。 三、技術特點不用固體支撐體，避免了物質的不可逆吸附、失活和變性等；滯留柱中的樣品可通過多種洗脫方式予以完全回收有廣泛的兩相溶劑體系可供選擇，大大增加其適用范圍；粗樣可以直接上樣而不會對柱子造成任何損害；操作成本低，制備量大；操作靈活，固定相和流動相之間可以互換作用；柱子可用合適溶劑清洗后重復使用。高速逆流色譜與高效液相色譜比較HPLC和HSCCC的固定相體積不同 理論塔板數的工作范圍不同；到目前為止，逆流色譜的最高分離效率低于5000理論塔板數。HSCCC

7、中溶質可以進入并接觸到液態(tài)固定相的整個體積；HPLC中，溶質不能進入到固體支撐體內部，僅涂漬在表面的有機層的液-固界面 HPLC有過載現象；HSCCC進樣體積可達到柱體積的20%，廣泛用于制備性分離。 HSCCC HSCCC與與HPLCHPLC是互補的分離技術是互補的分離技術參數參數HSCCCHSCCCHPLCHPLC固定相液體固體機理液-液分配（簡單）分配、吸附、離子交換、體積排阻等（復雜）溶質與固定相作用與液體固定相的整個體積相接觸在固定相與固體支撐體的界面相互作用上樣量高中等分離效率低高操作容易復雜費用便宜昂貴危險性高速運轉產生機械故障安全四、工作方法HSCCC的分離效果與以下因素有關：

8、所選擇的溶劑體系所選擇的溶劑體系固定相和流動相的選擇固定相和流動相的選擇洗脫方式洗脫方式儀器的轉向和轉速儀器的轉向和轉速樣品濃度樣品濃度進樣方式進樣方式1.1.柱溫等柱溫等1、溶劑體系的準備滿足以下要求滿足以下要求：p不造成樣品的分解與變性；p足夠高的樣品溶解度；p樣品在系統(tǒng)中有合適的分配系數值；p固定相能實現足夠高的保留。溶劑體系須給予足夠時間使兩相達到充分的平衡。溶劑體系須給予足夠時間使兩相達到充分的平衡。需要對混合溶劑進行脫氣。需要對混合溶劑進行脫氣。幾種常用的溶劑體系選擇方法參比已知的溶劑體系：文獻被分離物質種類被分離物質種類基本兩相溶劑體系基本兩相溶劑體系輔助溶劑輔助溶劑非極性或弱極

9、性物質正庚（己）烷-甲醇氯烷烴正庚（己）烷-乙腈氯烷烴正庚（己）烷-甲醇（或乙腈）-水中等極性物質氯仿-水甲醇，正丙醇，異丙醇乙酸乙酯-水正己烷，甲醇，正丁醇極性物質正丁醇-水甲醇，乙酸幾種常用的溶劑體系選擇方法分配系數測定法（K:0.5-2，用分析型HPLC確定）HPLC掃描法（15cm長C18柱，乙腈-水為流動相，梯度洗脫，觀察出峰位置）薄層色譜法生物活性物質分配比率法：只適用于生物活性成分分析型HSCCC法：用來選擇制備型分離時所用的溶劑體系2、柱系統(tǒng)的準備固定相注入螺旋管柱內重相為固定相：尾頭輕相為固定相：頭尾儀器以選定轉速轉動流動相以合適流速泵入柱內檢測器基線穩(wěn)定時，柱系統(tǒng)準備就緒進

10、樣分析3、樣品溶液的準備和進樣通常將樣品混合物溶解在分離所用的溶劑體系中樣品量較小時：可將樣品溶解流動相中樣品量較大時：建議將樣品溶解在相同體積的上相和下相溶劑的混合液中。（物理性質發(fā)生變化，樣品進入分離柱后，會導致固定相的嚴重流失）不能進太高濃度的樣品允許相當量的不溶性物質進入色譜柱4、洗脫方式梯度洗脫梯度洗脫（1 1）三元的溶劑體系）三元的溶劑體系 選擇溶劑1和溶劑2為兩種互溶溶劑（梯度溶劑）， 溶劑3不與前面任何一種互溶。 庚烷-甲醇-水體系：庚烷（固定相）水相（流動相） 乙酸乙酯-正丁醇-水體系：水（固定相）乙酸乙酯（流動相） 用于糖苷混合物的分離 糖苷溶解度：正丁醇 水 乙酸乙酯（2

11、 2）多元溶劑體系：）多元溶劑體系：情況復雜 正庚（己）烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系 上相：正庚（己）烷-乙酸乙酯有機相 下相：水-甲醇 甲醇變化 上相溶解在水相中 梯度溶劑一般總是使固定相體積減少。（3 3）線性梯度和步進梯度）線性梯度和步進梯度 雙向洗脫雙向洗脫 樣品組分覆蓋極性范圍寬，采用等比例或梯度洗脫都很難實現一次性分離。p第一步：反向洗脫極性的水相-流動相非極性的有機相-固定相p第二步：正向洗脫有機相-流動相 從相反方向泵入柱中雖然雙向洗脫得到的選擇性并不十分令人滿意，但是具有：被分離物質的全部回收、無不可逆吸附 以及有可能分離極性范圍非常寬的樣品組分，柱子可以重復使用而不需補充任何

12、溶劑等優(yōu)點。清空柱子清空柱子 利用逆流色譜的液態(tài)固定相的特性，即將保留在柱中對固定相有極強親和力，也就是分配系數高的成分，用多余的液體推出柱外以達到回收的目的。5、檢測紫外-可見光檢測器單波長、多波長UV-VIS制備型HPLC的檢測器（檢測池：直形的垂直流通型的。因為分析型HPLC的U形檢測池容易使固定相液滴滯留在池中，引起檢測器噪聲。）避免措施：輕相流動相從檢測池上端進入，向下流出； 重相流動相從檢測池下端進入，向上流出。蒸發(fā)光散射檢測器傅里葉紅外光譜檢測器 （HSCCC獲得高的溶質-溶劑比的流出物，使流動相吸收紅外光譜的問題得到解決。）薄層色譜檢測器（樣品噴霧裝置）質譜檢測器五、儀器結構分

13、析型制備型方法應用分析型分析型HSCCCHSCCC的應用的應用溶劑體系的快速篩選溶劑體系的快速篩選利用分析型HSCCC體積小、速度快、溶劑消耗小的特點。例：Pharma-tech的CCC-20分析型逆流色譜儀（柱體積43mL） Ito制備型多層螺旋管分離儀（柱體積280mL） 沙棘黃酮的分離分析型HSCCC上樣量3mg，分離過程15min；制備型HSCCC上樣量100mg，分離過程2.5hr。葛根異黃酮的分離分配系數的測定分配系數的測定 在CCC中，由于溶質的分配系數可以從色譜圖中計算而得，因此可以作為一種新型的測定分配系數的方法。例：系列烷基苯在正庚烷-甲醇-水體系中的分配系數小量天然產物樣

14、品的分離小量天然產物樣品的分離 粗樣或其它復雜樣品可以直接進樣而不需要預先處理，樣品也不會因為不可逆吸附而損失。例：多酚類物質的分離。 這類物質在HPLC上容易與色譜柱上的固體填料之間產生相互作用，而導致拖尾。在硅膠柱上易發(fā)生不可逆吸附。 HSCCC被認為是分離多酚類物質最有效的手段。例：植物粗提物的分離純化。 很好的樣品富集和預處理的手段。 分析型HSCCC作為一種為制備型HSCCC進行方法開發(fā)和小量樣品的分離純化手段，會有較好的應用前景。中藥指紋圖譜研究方面的應用中藥指紋圖譜研究方面的應用 在不可能將中藥復雜成分都搞清楚的情況下，指紋圖譜的作用是反映復雜成分的中藥及其制劑內在質量的均一性和

15、穩(wěn)定性。 HSCCC相對于其他色譜技術具有許多獨特有點。應用領域與拓展雙水相逆流色譜在蛋白質分離純化中的應用離心沉淀色譜在蛋白質等分離中的應用逆流色譜在手性分離中的應用逆流色譜在天然藥物工業(yè)中的應用雙水相逆流色譜在蛋白質分離純化中的應用雙水相逆流色譜在蛋白質分離純化中的應用雙水相體系（aqueous two-phase system, ATPS）是指某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以適當的濃度溶解會形成互不相溶的兩水相或多水相系統(tǒng)。通過溶質在兩相間分配系數的差異而進行分離的方法稱為雙水相萃取技術。最常見：聚乙二醇（PEG）-磷酸鹽水溶液體系 聚乙二醇（PEG）-葡聚糖（DEX）體系成功

16、用于蛋白質的大規(guī)模分離中。離心沉淀色譜在蛋白質等分離中的應用離心沉淀色譜在蛋白質等分離中的應用色譜分離是依據被分離物在兩相中分配系數的不同而進行；逆流色譜是利用物質在兩相液體中分配系數的不同實現分離；分離也可以依據被分離物在一個含有沉淀劑的濃度梯度變化的單一溶劑中的溶解度的不同而實現。 （前提：沉淀劑濃度梯度移動的速度遠低于溶劑流速）溶解度具有很小差異的物質，經過在柱中反復的沉淀和溶解即可達到分離。離心沉淀色譜離心沉淀色譜（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一種建立在類似于逆流色譜的不用固體支撐體的開放性通道基礎上的沉淀和溶解色譜。具

17、有一定濃度梯度的沉淀劑通過半透膜引入柱中，沉淀的樣品分子通過離心力保留在柱中?？朔藗鹘y(tǒng)色譜中由固體支撐體引起的樣品損失及柱子堵塞等問題。應用于蛋白質和一些合成高聚物的分離。原理：由一層半透膜隔開的一對通道構成的分離柱系統(tǒng)。上層：高濃度沉淀劑硫酸銨溶液下層：水 形成沉淀劑濃度梯度將一個混合樣品引入到下層通道，所有組分根據溶解度不同逐步沉淀下來；降低上層沉淀劑濃度開始分離洗脫。蛋白質分離條件的優(yōu)化 逆流色譜在手性分離中的應用逆流色譜在手性分離中的應用逆流色譜的優(yōu)勢獨特的高制備能力、低廉的液態(tài)固定相和低溶劑消耗；不需要采用化學手段將手性試劑鍵合到固體介質上，只需將其添加到液態(tài)固定相中即可；同一根逆流色譜分離柱可以反復多次用于不同手性化合物的分離，只需選擇合適的兩相溶劑體系和手性試劑；1.通過調節(jié)加入到液態(tài)固定相中手性試劑的量，同一根逆流色譜柱既可用于手性分析，也可用于手性制備性分離。儀器體系和操作步驟常用手性試劑N-十二烷?；?L-脯氨酸-3,5-二甲基?；桨罚―PA）磺化-環(huán)糊精（CD） CD是由6、7或8個吡喃糖（含手性碳原子）構成的環(huán)狀化合物，具有親脂性的內腔和親水性的周沿。當對映體的分子大小及憎水性與腔體相匹配，且和腔體周沿