高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物對(duì)小鼠免疫功能的影響

1、高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物對(duì)小鼠免疫功能的影響    作者：潘明， 趙弋清，侯若彤，劉素君，楊志榮【摘要】 目的研究高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物生理活性功能，對(duì)酶解物進(jìn)行了免疫活性實(shí)驗(yàn)。方法通過(guò)MTT法和中性紅比色法測(cè)定其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能、NK細(xì)胞殺傷毒性，鼠抗體生成脾細(xì)胞數(shù)(IgMPFC) 的影響。結(jié)果酶解物高、中劑量與對(duì)照相比ssB有顯著差異，而其中以高劑量組的活性最明顯，能夠SSBBww顯著提高小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力；激活小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，增強(qiáng)吞噬功能；增強(qiáng)NK細(xì)胞活性；增加www.8 t tt8

2、. com小鼠脾臟的抗體生成細(xì)胞數(shù)。結(jié)論 高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物能明顯提高正常小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫及NK細(xì)胞殺傷毒性的能力?！娟P(guān)鍵詞】 高原鼢鼠肉；木瓜蛋白酶； 酶解；免疫功能Abstract：Objective In order to investigate the physiological funtions of papain digest of Myospalaxbaileyi flesh protein, immune activity experiment was done with the digest. MethodsMTT method and neutral r

3、ed colorimetric method were applied to measure the effect of the digest on the proliferation of spleen lymphocyte of mice, the phagocytic function of celiac macrophage and reticuloendothelial system, the killing toxicity of NK cells, and the number of splenocyte induced by rat antibody (IgMPFC). Res

4、ultsThe groups with high and middle dosage have significant difference from the control group, with the high dosage group showing the most obvious activity. ConclusionThe papain digest of Myospalaxbaileyi flesh protein has a significant promotion effect on the cell and humoral immunity of normal rat

5、 as well as the killing and toxicity activity of NK cells.Key words：Myospalax baileyi meat； Papain； Hydrolysis； Immune function高原鼢鼠Myospalax baileyi是棲息于青藏高原的一種危害草場(chǎng)和農(nóng)田的數(shù)量巨大的地下嚙齒動(dòng)物。據(jù)營(yíng)養(yǎng)成分的分析結(jié)果（四川動(dòng)物待發(fā)），高原鼢鼠肌肉除含有亞油酸等對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸外，還有豐富的蛋白質(zhì),鈣、鎂、鐵、鋅、磷等無(wú)機(jī)鹽和煙酸、核黃素、視黃醇等維生素，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的蛋白質(zhì)資源。近年的研究表明，蛋白質(zhì)水解為小肽后就可以被

6、人體吸收1，而蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有蛋白質(zhì)無(wú)法比擬的生理功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。近幾年對(duì)高原鼢鼠肉的研究集中在脂溶性成分抗缺氧機(jī)制上25，目前尚未見(jiàn)對(duì)高原鼢鼠肌肉蛋白酶解液免疫功能的相關(guān)研究報(bào)道。為了dd dtt. com綜合開(kāi)發(fā)利用www.8 t t t8. com高原鼢鼠資源，變害為寶，提高高原鼢鼠肉蛋白的營(yíng)養(yǎng)和利用www.8 t t t8. com8ttt88 tt t 8. com，選擇成活細(xì)胞在95%以上8 t tt 8.c o m者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整ssbbwW.comdddtt對(duì)照，置5%CO2，37條件下培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸去上清液0.7 ml，加入不含小牛血清的RPMI16

7、40培養(yǎng)液，同時(shí)ssbbww. com加入MTT50 l/孔(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 ml酸性異丙醇，吹打均勻，使紫色結(jié)晶完全8 t tt8. com溶解，然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔分裝3孔作為dddtt8tTt8的表層瓊脂糖培養(yǎng)液，混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入CO2培養(yǎng)箱溫育1.01.5 h，然后將SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(110)加入到玻片架的凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.01.5 h，形成肉眼可見(jiàn)的空斑后計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。測(cè)定每5×106個(gè)脾細(xì)胞產(chǎn)生的空斑數(shù)。高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物對(duì)小鼠免疫功能的影響

8、|有關(guān)民法的論文資料dddtt效應(yīng)細(xì)胞；傳代培養(yǎng)的L929細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前1 d換液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.25%胰蛋白酶12 ml消化12 min，加完全8 t tt8. comRIMP1640培養(yǎng)液，吹打使其完全8 t tt8. com從壁上脫落，離心去上清，加含小牛血清的培養(yǎng)液，調(diào)至濃度為2×105/ml,作為dddtt靶細(xì)胞;在96孔板內(nèi)加入靶細(xì)胞懸液，每孔0.1 ml，放入37，5%CO2孵箱中培養(yǎng)1 h，使其貼壁成單層細(xì)胞，然后實(shí)驗(yàn)孔加入0.1 ml效應(yīng)細(xì)胞懸液，做4個(gè)復(fù)孔，靶細(xì)胞對(duì)照孔加完全8 t tt8. comRIMP1640培養(yǎng)液0.1 ml；然后將96孔板放在37，5%CO2

9、孵箱中孵育20 h，去上清用生理鹽水輕輕注滿(mǎn)各孔，反復(fù)3次，以除去效應(yīng)細(xì)胞和被殺傷脫落的靶細(xì)胞，在濾紙上吸干孔內(nèi)水分；每孔加入0.1 ml的0.1%中性紅染液，孵育30 min，棄去染液，用生理鹽水洗3遍，每孔加0.1 ml細(xì)胞溶解液，使含有中性紅的靶細(xì)胞溶解，搖勻，用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，波長(zhǎng)450 nm，用以下公式計(jì)算殺傷率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析檢驗(yàn) 。殺傷率(%)=(靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)靶細(xì)胞OD值×100%2 結(jié)果2.1 水解液的成分分析在以上8 t tt 8.c o m確定的最佳條件下水解得到的水解液呈淡黃色透明狀態(tài)www .ddd Tt. com，氨基酸分析結(jié)果見(jiàn)表1。

10、表1 水解液的游離氨基酸和總氨基酸的分析（略）2.2 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比ssB，不同劑量組酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖活性均有一定影響，存在明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，其中在濃度較低（低劑量組）時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖活性的調(diào)節(jié)作用很小，隨著添加濃度的增大，作用逐漸8ttt8明顯，當(dāng)濃度為 0.4 g/ kg（高劑量組）時(shí)，增殖作用達(dá)到最大，與正常對(duì)照組比較 ，差異有顯著意義（P0.05）。從表1可見(jiàn)，高原鼢鼠肉蛋白水解液含8種必需氨基酸在內(nèi)的17種氨基酸，且必需氨基酸占總氨基酸量的46.58%，說(shuō)明高原鼢鼠肉水解后其必需氨基酸數(shù)量充足，組成比例較為合理，符合FAO/WH

11、O建議的人體必需氨基酸模式；E/N=0.92，大于 FAO/WHO推薦的0.6；高原鼢鼠水解液中含有較高量嬰幼兒所需的組氨酸和精氨酸，所以8ttt8高原鼢鼠肉水解液是一種優(yōu)質(zhì)蛋白液；由于www.ddd tt. com其中氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等)的含量較高，占氨基酸總量的26.11%，故水解液味道非常鮮美。2.3 酶解液對(duì)小鼠抗體生成脾細(xì)胞數(shù)(IM-PFC)的影響圖2顯示，各組小鼠脾臟的抗體生成細(xì)胞數(shù)依次升高，其中，酶解液高劑量組、中劑量組與對(duì)照組比較，差異具有顯著性意義 (P0.05)，說(shuō)明酶解液具有增強(qiáng)小鼠特異性體液免疫的功能。圖3顯示，酶解液低劑量組、酶解液中劑量組、酶

12、解液高劑量組與生理鹽水組比較，NK殺傷率均有提高；其中，酶解液低劑量組、酶解液中劑量組、與生理鹽水組比較，差異具有顯著性意義 (P0.05)；酶解液高劑量組與生理鹽水組比較，差異具有極顯著性意義 (P0.01)，說(shuō)明高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶解液能提高機(jī)體免疫力。3 討論高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶解產(chǎn)物是氨基酸與多肽的混合物，酶解能改變蛋白質(zhì)的功能特性，如酶解能大大提高其溶解性；一定程度的水解也能提高其乳化性等，肽作為dddtt動(dòng)物消化道蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，是被迅速吸收的氨基酸供體，能夠SSBBww調(diào)節(jié)動(dòng)物體消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫等系統(tǒng)的生命活動(dòng)，這類(lèi)物質(zhì)被稱(chēng)為腔內(nèi)信號(hào)分子，隨著肽吸收理論為越來(lái)越多的人們

13、接受，活性肽在動(dòng)物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)中的作用愈發(fā)受到關(guān)注，因而有人提出蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)是肽的營(yíng)養(yǎng)。機(jī)體免疫功能特別是細(xì)胞免疫功能下降，是導(dǎo)致www.d dd tT. com細(xì)菌和病毒感染等發(fā)病率高的主要因素，體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是目前測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)www .ddd Tt. com的一種較好8 t tt 8.c o m的方法9。自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）是一類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫功能的組成部分，能非特異性地殺傷靶細(xì)胞，參與細(xì)胞免疫，在腫瘤免疫、抗病毒感染中也具有重要作用，其介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用是腫瘤細(xì)胞免疫監(jiān)視的第一道防線(xiàn)，因而，NK細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用越來(lái)越受到重視，是目前已被公認(rèn)的

14、免疫監(jiān)視中最重要的效應(yīng)細(xì)胞。因此www.8 t tt8. com，研究生物活性物質(zhì)對(duì) NK細(xì)胞殺傷活性的影響有重要意義。對(duì)T-細(xì)胞依賴(lài)的抗原SRBC的抗體反應(yīng)是體液免疫能力的體現(xiàn)ssbbWw，它是免疫力分析中最敏感和最優(yōu)先的參數(shù)10，體內(nèi)對(duì)SRBC的抗體反應(yīng)，是反映了增加www.8 t tt8. com抗原細(xì)胞、T-細(xì)胞、B-細(xì)胞之間協(xié)同能力的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)為了dd dtt. com綜合開(kāi)發(fā)利用www.8 t t t8. com高原鼢鼠資源，探討高原鼢鼠肉酶解液對(duì)小鼠免疫功能的影響，變害為寶，提高高原鼢鼠肉蛋白的營(yíng)養(yǎng)和利用www.8 t t t8. com價(jià)值，采用酶法水解高原鼢鼠肉得到的酶

15、解物，針對(duì)免疫系統(tǒng)中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明酶解物具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫活性、體液免疫活性及NK細(xì)胞殺傷毒性的能力?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1黃鸝虹. 大豆多肽的生理功能及應(yīng)用J.食品科技， 1999，3：50.2魏登邦，張寶琛. 高原鼢鼠肉抗缺氧成分的篩選J.中國(guó)獸醫(yī)科技，2003，33（2）：56.3魏登邦，張寶琛.高原鼢鼠肉脂溶性物質(zhì)的抗缺氧效果與化學(xué)成分J.動(dòng)物學(xué)報(bào)2002，8(6)：7644劉海春，魏登邦. 高原鼢鼠肉脂溶性物質(zhì)抗缺氧機(jī)制的探討J.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2003，4 ： 7.5魏登邦,張寶琛. 高原鼢鼠肉脂溶性部分的抗氧化效果J.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002，7：1.6潘 明，侯若彤，王曉峰，等. 高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶水解工藝研究J.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（工程科學(xué)版）2005，37(3):68.7杜