流式細胞儀的使用程序

1、流式細胞儀的使用程序血液病實驗診斷中心一.開機程序1. 檢查穩(wěn)壓器電源，打開電源，穩(wěn)定5分鐘。2. 打開儲液箱，倒掉廢液，并在廢液桶中加入400ml漂口水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水,做分選必須用PBS或FACSFlow),合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。3. 將FACSCalibur開關(guān)打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應是STANDB河熱5-10分鐘。排出過濾器內(nèi)的氣泡。4. 如果需要打印，打開打印機電源。5. 打開電腦,等待屏幕顯示出標準的蘋果標志。6. 執(zhí)行儀器PRIM或能一次，以排除Flowcell中的氣泡。7. 分析樣品時，先用

2、FACAFlowlgPBS進彳fHIGHRUN勺2分鐘。做過分選后,每次開機后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，趣下右下角口色按鈕開始沖洗。待自動停止后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。二?預設(shè)獲取模式文件(AcquisitionTemplateFi.les)1 .從蘋果標志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。2. 選取屏幕左列繪圖工具中的Dotplot,繪出一個或多個DotPlots（點圖）。從DotPlot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源，并確定適當?shù)膞軸和y軸參數(shù)。3. 選取屏幕左列繪圖工具中的Histogr

3、am,同上法可繪出Histogram（直方圖）。4. 將此視窗命名后儲存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夾中，下次進行相同實驗時可直接調(diào)用。.本計算機中已設(shè)定兩個模式文件：ACQF口EXP,儲存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夾中，ACQffi于細胞DA檢測，EXP用于細胞表面標志分析。三.用CELLQuest進行儀器的設(shè)定和調(diào)整1. 從蘋果畫面中選取CELLQuest,進入CELLQues詬在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。2. 從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Con

4、necttoCytometer（快捷鍵：+B）進行電腦和儀器的連機。將出現(xiàn)的AcquisitonControl對話框移至合適位置。3. 從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps>Threshold、CompensationStatus等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時隨時調(diào)整獲取件。也可以用+1,2,3,4獲得此四個對話框。4. 在Detectors/Amps對話框中，先為每個參數(shù)選擇適'"|的倍增模式（amplifiermode:線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時，F(xiàn)SG口SSC多

5、以線t模式Lin測且DDMParam選擇FL2,而FL1,FL2與FL3貝U以對數(shù)模式Log測M;分析細胞DNAM時，F(xiàn)SC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin進行測量，且DDMParang擇FL2;分析血小板表型時,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log進行測量。5. 放上待檢測的樣品，將流式細胞儀設(shè)定于RUN流速可在HIGH或LOWK6. 在AcquisitonControl對話框中，選取Acquire,開始獲取細胞。在以下的儀器調(diào)整過程中隨時選取Pause,Restart以觀察調(diào)整效果。未完全調(diào)整好之前不要去掉SETUPO勺。7. 在Detectors/Amps對話框中

6、，調(diào)整FSCmSSCB測器中的信號倍增度：PMTvoltages（粗調(diào)）與AmpGains（細調(diào)），使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC（圖內(nèi),且三群細胞合理分布。8. 在Threshold對話框中選擇適當?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold,并調(diào)整Threshold的高低，以減少噪音信號（細胞碎片）。一般做細胞表型時用FSC-H而做DNA寸用FL2-HoThreshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫面質(zhì)io9. 從屏幕左列繪圖工具中選取Region（區(qū)域），并在靶細胞周圍設(shè)定區(qū)域線，即通常所說的門。圈定合適的細胞群可使儀器調(diào)整更為容易。10. 在Detectors/Amps對話框中，調(diào)整熒光檢測

7、器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對照樣品調(diào)整細胞群，使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。11. 在Compensation對話框中，根據(jù)所用的調(diào)補償用標準熒光樣品調(diào)整雙色（或多色）熒光染色所需的熒光補償。比如應該為FL1+FL2-的細胞群卻分布在FL1+FL2越域內(nèi)，則需調(diào)大FL2-?%FL1中的“？”，并從FL1-FL2點圖中觀察新的調(diào)整是否恰當12. 在Status對話框中可見:LaserPower:正常值一Run/Ready為14.7mW,Standby為5mW;Lasercurrent:正常值為6Amps左右。13. 調(diào)整好的儀器設(shè)定可在InstrumentSe

8、ttings對話框中儲存，下次進行相同實驗時可調(diào)出使用，屆時只需微調(diào)即可。2. 本計算機中已有三個名叫儲存于CELLQuest Folder IMMInstrSettingsSettings Files CalibFile Mast-Cell-Set胞，后者用于分析小鼠肥大細胞。FACStation G3 BD Applications及 FACStation G3 BD Files Instrument的參數(shù)文件，前二者可用于分析人白細.通過預設(shè)的獲取模式文件進行樣品分析1. 從蘋果標志中選擇CELLQUES新視窗出現(xiàn)后從File指令欄中選擇Open,2. 從屏幕上方Acquire指令欄中，

9、選取ConnecttoCytometer進行電腦和儀器的連機。將出現(xiàn)的AcquisitonControl對話框移至合適位置。3. 從Cytometer指令欄中選取InstrumentSettings,在其對話框中選擇Open以調(diào)出以前存儲的相同實驗的儀器設(shè)定，按Set確定。4. 在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲存的細胞數(shù)，參數(shù)，信號道數(shù)。其中Resolution在做細胞表面標志時選擇256，做DNA寸選擇1024。ParameterSaved則根據(jù)不同的檢測對象選擇不同的參數(shù)。5. 在Acquire指令欄中，選擇ParameterDescrip

10、tion,以決定文件存儲位置(folder),文件名稱(file)，樣品代號以及各種參數(shù)的標記(panel),即安排tubel,2,3的檢測參數(shù)。一般本儀器獲取的數(shù)據(jù)按照檢測對象的不同分別儲存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DA文件夾中。文件根據(jù)日期命名。6. 在Cytometer指令欄中，選擇Counters,將此對話框移至合適位置，以便于隨時觀察events計?數(shù)。7. 將樣品試管放至檢測區(qū)，在AcquireControl對話框中選取Acquire以啟動樣品分析測定。8. 微調(diào)儀器設(shè)定，待細胞群分布合適后選擇Acqu讓eControl對話框中Pause,Abort,去除Setup前的“3”，開始正式獲取信號，存儲數(shù)據(jù)。9. 當一定數(shù)口的細胞被測定后，獲取會自動停止，并會自動存儲數(shù)據(jù)。重復步驟7,繼續(xù)分析下一個樣品，直到所有的樣品數(shù)據(jù)分析完畢。.當所有樣品分析分析完畢，即換上三蒸水,并將流式細胞儀置于“STANDB”Y狀態(tài)，以保護激光管。五.關(guān)機程序：1. 從File中選擇Quit,退出軟件，選擇Don'tSave至蘋果屏幕。2. 用4ml1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位(vacuumison),以外管吸去約2ml,在將樣品架置于中位(