環(huán)境水樣品中大腸桿菌及糞耐熱大腸桿菌的檢測

1、環(huán)境水樣品中大腸桿菌及糞（耐熱）大腸桿菌的檢測【摘要】本次實驗采用多管發(fā)酵法檢測環(huán)境水樣中大腸桿菌及糞大腸桿菌（環(huán)境水樣取用水果湖樣點水樣）。本次試驗（多管發(fā)酵法）的主要步驟為：將待測水樣稀釋三個（實際上做了四個）適宜稀釋倍數梯度，接種在乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，37下培養(yǎng)24h，觀測結果。產酸產氣為陽性結果，不產酸產氣為陰性。將陽性管中菌液取定量接種于EC肉湯培養(yǎng)液中，45下培養(yǎng)24h，觀測結果。產酸并產氣為陽性結果，不產酸不產氣為陰性。將陽性管中菌及之前37管中菌接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上，于對應溫度下培養(yǎng)24h，鏡檢。根據菌落形態(tài)和顏色，可確認大腸桿菌陽性結果。根據大腸桿菌陽性管數的MPN檢索可查

2、水樣中總大腸桿菌和耐熱大腸桿菌的最大或然數。再與中華人民共和國地表水環(huán)境質量標準(GB3838-2002)對比，判定水質?！娟P鍵詞】 環(huán)境水樣 大腸桿菌 耐熱大腸桿菌 多管發(fā)酵法 最大或然數（MPN） 產酸產氣 【前言】水體的污染程度可大致由總大腸桿菌數及耐熱大腸桿菌數反映出來。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，無芽胞，糖代謝時可產酸產氣，可使溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，并可通過伊紅美藍培養(yǎng)基鑒定，大腸桿菌發(fā)酵乳糖造成的酸性環(huán)境，使兩種染料結合成復合物，使菌群產生帶核心的，有金屬光澤的深紫色菌落。耐熱大腸桿菌是一種特殊的大腸桿菌，由于它多見于人類或動物的糞便中，可耐高溫，當由37環(huán)境變?yōu)?5時，依舊可以正常

3、生長。當水體被糞便污染時，其含量較高，由此判斷水質高低。【材料與方法】：（一） 材料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化鈉5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、蒸餾水1000ml （10ml/試管+小倒管 20支）EC肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g、3號膽鹽1.5g、乳糖5g、磷酸氫二鉀4g、磷酸二氫鉀1.5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml （10ml/試管+小倒管 10支） 伊紅美藍培養(yǎng)基：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂2030g、2%伊紅水溶液20ml、0.5%美藍水溶液13ml、蒸餾水1000ml （150ml/瓶） 4.5 mL無菌水：4支 （二）

4、器材無菌1 mL移液管：4支；40200 微升移液器、吸氣器：各1支；200微升無菌Tip：20只；載玻片和蓋玻片若干；革蘭氏染色各試劑；培養(yǎng)皿若干套；酒精燈；顯微鏡等（二） 原理及方法1、 樣品的稀釋和培養(yǎng)： 取原環(huán)境水樣0.5ml加入到4.5ml無菌水中，混合均勻，制成 10-1樣品；再從10-1樣品中溶液取0.5ml加入到4.5ml無菌水中，混合均勻，制成10-2樣品；再從10-2樣品中溶液取0.5ml加入到4.5ml無菌水中，混合均勻，制成10-3樣品，再從10-3樣品中溶液取0.5ml加入到4.5ml無菌水中，混合均勻，制成10-4樣品，每個稀釋度兩管。再從10-1、10-2 、10

5、-3和10-4樣品中各取1ml到乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中（每個稀釋度樣品各5支試管）2、初發(fā)酵實驗：原理：發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產酸產氣。為便于觀察細菌的產酸情況，培養(yǎng)基內加有溴甲酚紫作為PH指示劑，細菌產酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色。溴甲還有抑制其他細菌如芽孢桿菌的生長的作用。方法：（1）將上述15支試管放入37中培養(yǎng)24h；（2）取出試管觀察，若發(fā)現試管由紫色變成了黃色，即證明產酸；若發(fā)現小倒管中有氣泡產生，即證明產氣；（3）記錄各試管的產酸產氣的情況，將陽性反應（產酸產氣）的試管中的樣品取一滴

6、（50）L轉接于EC培養(yǎng)基上，并做好標記。注：在量少的情況下，也可能延遲48h后才產酸產氣，此時應視為可疑結果。48h培養(yǎng)后仍不產酸產氣的為陰性反應。 3、45培養(yǎng)鑒定： 原理：37下培養(yǎng)產生陽性反應的試管樣品不一定是全部都是糞大腸桿菌，經過45下培養(yǎng)，若還能產生陽性反應的即可能為糞大腸桿菌（耐熱性較好） 方法：（1）將上一步接種的EC培養(yǎng)基的試管置于45下培養(yǎng)24h； （2）取出試管觀察，記錄發(fā)生陽性反應的試管（產酸并產氣）4、平板分離： 原理：伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅和美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，該兩種染料即結合成復合物，使大腸菌群產生帶核心的、有金屬光澤的

7、深紫色（龍膽紫的紫色）陽性菌落。 方法：（1）將37培養(yǎng)管（48h）和45培養(yǎng)中的發(fā)生陽性反應的試管中的菌接種于伊紅美藍培養(yǎng)平板，分別再于37和45的條件下培養(yǎng)過夜。 （2）培養(yǎng)過夜后取出平板，挑選深紫色、具金屬光澤，紫黑色、不帶或略帶金屬光澤，淡紫紅色中心顏色較深的菌落。 5、革蘭氏染色： 原理：大腸桿菌為革蘭氏染色陰性菌，經過革蘭氏染色后在顯微鏡下顯示為紅色桿狀（有的能觀察到芽胞）。 方法：挑選伊紅美藍培養(yǎng)陽性的菌落，進行革蘭氏染色，鏡檢為紅色且無芽胞即為大腸桿菌群。 6、查閱MPN表，得出全部大腸桿菌和耐熱大腸桿菌的最可能數。【結果與討論】1. 實驗結果記錄 1.1 37培養(yǎng)24小時后，

8、10-1、10-2和10-3均產酸產氣，為陽性結果；10-4中只有C管產酸產氣，其余四管不產酸不產氣?，F象試管號產酸產氣10-1 A + B +C + D + E +10-2 A + B +C + D + E +10-3 A + B +C + D + E +10-4 A B C + D E “+”為有此現象，“”為無此現象。37 10-1稀釋度37 10-2稀釋度 37 10-3稀釋度37 10-4稀釋度1.2 陽性管中樣品接種于EC培養(yǎng)基（16管），45培養(yǎng)24小時后，10-1、10-2和10-3的AE管均產渾濁產氣，10-4的C管中不產渾濁不產氣（A、B、D、E管37下為陰性，不接種至45

9、）現象試管號產酸產氣10-1 A + B + C + D + E +10-2 A + B + C + D + E +10-3 A + B + C + D + E +10-4 C 45 10-1稀釋度45 10-2稀釋度45 10-3稀釋度1.3 37和45培養(yǎng)過24小時后的陽性和假陽性管中的菌于伊紅美蘭平板培養(yǎng)，鏡檢結果及革蘭氏染色結果如下：試管號現象溫度 37 45菌落顏色菌體形狀革蘭氏染色菌落顏色菌體形狀革蘭氏染色10-1A白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性B白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性C白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀

10、陰性D白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性E白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性10-2A白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性B白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性C白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性D白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性紫，無明顯金屬光澤 短桿狀陰性E白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性紫，無明顯金屬光澤 短桿狀陰性10-3A白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性B白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性C白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短

11、桿狀陰性D白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性E白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性10-4A無菌落桿狀陰性B少量透明菌落桿狀陰性C少量透明菌落（略帶紫）桿狀陰性D少量透明菌落桿狀陰性E無菌落桿狀陰性伊紅美藍實驗 37伊紅美藍實驗 45革蘭氏染色結果，依次為陽對，陰對，樣品代表1.4 查MPN表結果45時，10-1、10-2、10-3的陽性管數依次為5,5,5。通過生活飲用水標準檢驗方法微生物指標（GB/T5750.12-2006）查表可知，環(huán)境水樣品的總大腸菌群數為1600MPN/100ml，即160000MPN/L。2. 有關該樣品水質的判斷根據中華

12、人民共和國地表水環(huán)境質量標準(GB3838-2002)，該樣品水質為類（糞大腸菌群（個/L）<=40000）。3. 結果分析 （1）實驗檢測結果表明，取樣點（水果湖）的水質為類，屬于較差級別類。我們根據取樣點的圖片（如下）分析，該處河流渾濁，顯棕綠色，且河水流速小，周圍植被覆蓋少，附近可能有下水道排污口，因此水中大腸桿菌的含量較多。特別是糞大腸桿菌，能在該環(huán)境下進行大量繁殖，造成水體污染。（2） 本實驗中，在37前三個稀釋度的伊紅美藍實驗對應的接種區(qū)均是白色菌落和紫色金屬光澤菌落同時存在，且都不少，而在45的三個稀釋度的15個接種區(qū)里均是深紫帶金屬光澤。說明在37下還有大腸桿菌之外的別種

13、菌也是優(yōu)勢菌種，而耐熱大腸桿菌能耐高溫，在45下成了唯一的優(yōu)勢菌種，從而白色菌落未出現。（3）在37下顯示為陽性的10-4C管在45下為陰性，可能的原因有是，那一管中確有大腸桿菌，只是耐熱大腸桿菌濃度極低或沒有，所以在高溫下顯示為陰性。而至于為什么同稀釋度其它四管沒有此現象，可能是該稀釋度的菌液沒有混合均勻造成的。（4）本實驗檢測的對象為大腸菌群，大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群

14、是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小?！緦嶒灨邢搿?微生物學與我們的生活緊密相關，不僅是因為微生物在現實世界里無處不在，更是因為它們對我們生活的影響表現在與人類及其他生物的方方面面。與生科院其他實驗一樣，我們在教學周里不斷演練著基本的實驗技巧，并在最后的開放實驗中將之運用到實際，并解決一些簡單的問題，為今后更高層次的科學研究打下基礎。與大一的動生、植生實驗不同的是，我們的每一次實驗可討論的東西都更多，需要開始查找大量的文獻資料，這是一個生科人的特點，也極大地提高了我們閱讀、理解并運

15、用高水平資料的能力。在論文的海洋里，我們發(fā)現了更多與微生物相關的信息，極大地拓寬了我們的視野，激發(fā)了我們的興趣。 此次開放實驗雖然操作過程較為簡單，但卻教會我們如何將一份文件真正讀懂，并學會實際運用。我想這就是老師開設此開放實驗真正目的。經過本次對水樣品中微生物的含量檢測，我們意識到微生物在我們生活中的巨大作用，既有積極方面也有消極方面。我們可以利用微生物為我們提供很多環(huán)境信息，以警示我們周圍環(huán)境的狀況。環(huán)境惡化的罪魁禍首不是我們觀測到的微生物，而是我們人類對環(huán)境的破壞和沒有及時有效地進行改善。從這么多年對武漢典型地點的水樣結果來看，水質改善收效甚微，我們還有很長的一段路要走。 剛開始遇到這個

16、實驗時，看到資料里講到的各種數量龐大的儀器、試劑，會擔心這個實驗會很難做。但做完才發(fā)現，數量龐大是有很強的理論做支撐的，多梯度、高重復本就是科學實驗的特點，只是在微生實驗中體現得更充分，也與今后的科學研究多梯度、高重復特點更接近。大量的儀器與藥品試劑及高重復的分步實驗也考驗著我們如何在實驗前進行合理規(guī)劃，如何在實驗過程中有條不紊、頭腦清醒，如何在實驗后進行妥善處理。因此這個實驗對于嚴謹的科學態(tài)度和良好的實驗習慣的要求特別突出，也給了我們極大的鍛煉。 一直都對微生物學實驗信心不是很足，尤其是開放實驗這種需要連續(xù)好幾天高密度操作的實驗。但當我進行取樣、接種、劃線之類的無菌操作以及其他各種開放操作時，我發(fā)現經過這一學期的鍛煉，其實我已經能夠很熟練地進行各種操作了。謝老師一直強調的熟能生巧我算是領會到了。而這學期多次以小組為單位的實驗操作也使我們小組在這次開放實驗中配合得很默契，這也是多次演練的結果。所以說，在將理論運用于實際之