大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展綜述

1、基因工程制藥綜述班級(jí)：生技132姓名：學(xué)號(hào)：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展綜述自上世紀(jì)70年代以來(lái)，大腸桿菌一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。盡管基因工程表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)從大腸桿菌擴(kuò)大到酵母、昆蟲(chóng)、植物及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且近年來(lái)出現(xiàn)了很多新型的真核表達(dá)系統(tǒng)，但是大腸桿菌仍然是基因表達(dá)的重要工具。尤其是進(jìn)入后基因組時(shí)代以來(lái)，有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及功能研究的開(kāi)展，對(duì)基因表達(dá)的要求更高，這時(shí)大腸桿菌往往是表達(dá)的第一選擇。文章綜述了近年來(lái)有關(guān)大腸桿菌表達(dá)載體及宿主細(xì)胞的改造工作。1. 1表達(dá)載體1表達(dá)調(diào)控構(gòu)建有效的表達(dá)載體是表達(dá)目的基因的基本要求，同時(shí)也是影響基因表達(dá)水平以及蛋白活性的重要因素。標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌

2、表達(dá)載體的主要組成：?jiǎn)?dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始區(qū)、多克隆位點(diǎn)、終止子、復(fù)制起點(diǎn)以及抗性篩選因子等。理想的表達(dá)載體要求在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上可以控制目的基因的表達(dá)，然而目的基因在宿主體內(nèi)過(guò)分表達(dá)（選用較強(qiáng)的啟動(dòng)子等）會(huì)對(duì)宿主造成壓力，引起相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，影響蛋白的活性等?；蚪M、RNA轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝調(diào)控組等領(lǐng)域的研究成果給我們提供了大量關(guān)于基因表達(dá)調(diào)控的信息1?，F(xiàn)已能從基因和細(xì)胞的整體水平來(lái)方便地選擇合適的啟動(dòng)子或合理開(kāi)發(fā)新的載體系統(tǒng)。譬如Lee等利用二維凝膠電泳法比較了重組載體和空載體被分別轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后蛋白組學(xué)的差異,發(fā)現(xiàn)兩者都產(chǎn)生了大腸桿菌熱休克蛋白并引起了cAMPC

3、RP調(diào)節(jié)蛋白的應(yīng)答，其中重組子的影響更為強(qiáng)烈；另外，還發(fā)現(xiàn)外源基因的表達(dá)使宿主核糖體合成速率、翻譯延長(zhǎng)因子和折疊酶表達(dá)水平、細(xì)胞生長(zhǎng)率下降，而使細(xì)胞呼吸活力上升2。目前應(yīng)用的表達(dá)載體主要問(wèn)題是表達(dá)過(guò)程中出現(xiàn)的全或無(wú)的情況，通常表達(dá)的培養(yǎng)物都是非純種的細(xì)胞群，其中有一些細(xì)胞可以最大限度地被誘導(dǎo)，而另一些細(xì)胞在誘導(dǎo)后基因的表達(dá)被關(guān)閉。分離具有合適強(qiáng)度啟動(dòng)子及翻譯速率的載體變種可以優(yōu)化表達(dá)水平，說(shuō)明啟動(dòng)子的選擇對(duì)于基因的誘導(dǎo)表達(dá)非常重要。Deborahat提出在芯片上排列具有不同強(qiáng)度級(jí)別啟動(dòng)子的載體進(jìn)行互補(bǔ)分析，可能有助于篩選最為適合的啟動(dòng)子3。開(kāi)發(fā)非IPTG或阿拉伯糖誘導(dǎo)的載體也可以提高基因表達(dá)水

4、平，Qing等利用cspA基因的獨(dú)特性開(kāi)發(fā)了一系列冷休克表達(dá)載體pCold,使目的基因在低溫下（15C）誘導(dǎo)表達(dá)，提高了產(chǎn)物的溶解性和穩(wěn)定性4。1.2 融合表達(dá)載體除了表達(dá)載體的調(diào)控性，為了提高蛋白產(chǎn)物的活性以及簡(jiǎn)化下游純化的操作等，往往在表達(dá)載體上插入其它輔助的基因序列與目的基因構(gòu)成融合蛋白表達(dá)。融合信號(hào)肽（PelB、OmpA、MalE、PhoA等）表達(dá)可以使融合蛋白通過(guò)經(jīng)典的Sec途徑分泌到周質(zhì)或胞外表達(dá)，有利于形成二硫鍵以及避免胞質(zhì)蛋白酶的水解和N端甲硫氨酸的延伸。另外，最近開(kāi)發(fā)的雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系（Tat）可以有效分泌正確折疊的重組蛋白5。常見(jiàn)的純化標(biāo)簽多根據(jù)親和層析的配體來(lái)選擇，如6H

5、is、GST、CAT、MBP等經(jīng)過(guò)一步親和純化可以得到均一性較高的產(chǎn)物,但化學(xué)洗脫會(huì)對(duì)產(chǎn)物的活性產(chǎn)生一定的影響。Ca2瓶賴的鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）和鏈球菌親和素結(jié)合肽（SBP）作為純化標(biāo)簽時(shí)，只需要在洗脫液中移去標(biāo)簽依賴的離子或小分子就能實(shí)現(xiàn)溫和的特異性洗脫6,7。再者，應(yīng)用一些非層析的純化標(biāo)簽在純化操作中非常經(jīng)濟(jì)實(shí)用，如熱敏型的類彈性蛋白多肽（ELPs）可以使蛋白產(chǎn)物在溶解態(tài)和非溶解態(tài)之間轉(zhuǎn)變后續(xù)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)循環(huán)的純化方法可以達(dá)到親和純化的回收率同。另外，在純化標(biāo)簽與目的蛋白之間插入一些特殊的短肽，同時(shí)融合剪切酶可以在純化操作中利用標(biāo)簽的自剪切直接得到產(chǎn)物蛋白。例如SrtAc酶所識(shí)別的短肽序列

6、GTEPL,在蛋白N端依次連接短肽、剪切酶、6His融合表達(dá)，親和上柱后剪切酶發(fā)揮作用使N端帶有Gly的目的蛋白從融合狀態(tài)中釋放出來(lái)陰。噬菌體展示庫(kù)是表達(dá)抗體或其它蛋白庫(kù)的重要克隆技術(shù)，與之相似將目的基因同適合的錨定序列融合可以使產(chǎn)物蛋白表達(dá)到大腸桿菌的表面。大腸桿菌展示所用的融合配體一般為細(xì)菌的膜蛋白或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，如PadL是大腸桿菌長(zhǎng)鏈脂肪酸的一種外膜轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白,N端融合PadL表達(dá)胞內(nèi)酶，以全細(xì)胞的形式催化反應(yīng)表現(xiàn)出非常高的穩(wěn)定性阿；Yang等利用惡臭假單胞菌Pseudomonasputida外膜酯酶EstA的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域作為表達(dá)胞內(nèi)3-內(nèi)酰胺酶的錨定基序，結(jié)果表明蛋白展示在細(xì)胞膜外并沒(méi)有

7、影響細(xì)胞的活力11。1.3 共表達(dá)載體很多真核基因表達(dá)的產(chǎn)物都必須以多聚復(fù)合體的形式組合才能表現(xiàn)出相應(yīng)的活性，因此在表達(dá)這一類目的基因的時(shí)候常構(gòu)建共表達(dá)載體，另外共表達(dá)的策略在輔助新生蛋白質(zhì)的折疊和分泌中也很有意義。Dzinenu等針對(duì)表達(dá)異源二聚體構(gòu)建了可以同pET載體共表達(dá)的載體pOKD,這種載體含有p15A復(fù)制起點(diǎn)，所以可以和大多數(shù)大腸桿菌表達(dá)載體共存于細(xì)胞中12。細(xì)菌釋放素蛋白（BRP）屬于細(xì)菌中的一類分泌蛋白，共表達(dá)目的蛋白與BRP可以促進(jìn)產(chǎn)物直接釋放到培養(yǎng)基中13。另外，共表達(dá)分子伴侶也是促進(jìn)蛋白正確折疊的手段。目前對(duì)于分子伴侶構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)模式還處于探索階段，研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中常見(jiàn)的

8、分子伴侶GroEL、Hsp同系物DnaK并非細(xì)胞內(nèi)所有蛋白折疊所必需的，只有同核糖體結(jié)合的觸發(fā)因子協(xié)調(diào)作用才能促進(jìn)蛋白的適當(dāng)折疊阿。但是，合理選擇個(gè)別的分子伴侶共表達(dá)可以避免產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤的折疊以及沉積。Marco等設(shè)計(jì)了共表達(dá)分子伴侶的3載體系統(tǒng)，其中兩種載體分別攜帶不同的分子伴侶，另外一種載體攜帶目的基因，分子伴侶與目的基因被分別獨(dú)立誘導(dǎo)14。Cpn60和Cpn10是從嗜冷菌中分離的一類分子伴侶，共表達(dá)后可以使大腸桿菌在4C低溫下生長(zhǎng)，有利于蛋白的正確折疊15。與分子伴侶類似，共表達(dá)DsbA或Dsbc等二硫鍵相關(guān)蛋白可以輔助形成正確的二硫鍵。1.4 雙雜交系統(tǒng)融合表達(dá)和共表達(dá)的另一個(gè)應(yīng)用

9、是利用雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的相互作用。大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)也是有3種載體構(gòu)成，誘餌蛋白融合表達(dá)載體、捕獲蛋白融合表達(dá)載體和報(bào)告基因表達(dá)載體16。以AraC/LexA雙雜交系統(tǒng)為例，誘餌載體的啟動(dòng)子選用IPTG誘導(dǎo)的pTrc,誘餌蛋白融合在轉(zhuǎn)錄激活因子ArcC的N端表達(dá)，帶有卡那霉素的抗性基因；捕獲載體的啟動(dòng)子選擇非IPTG誘導(dǎo)的pTet,可以在去水四環(huán)素的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄，捕獲蛋白融合在LuxA操縱子效應(yīng)物L(fēng)uxA的N端，帶有氨芳青霉素的抗性基因；報(bào)告基因LacZ的啟動(dòng)子選用大腸桿菌的araBAD啟動(dòng)子，其活性依賴于上游的AraC操縱子，同時(shí)在啟動(dòng)子下游安置3個(gè)定向重復(fù)的LexA操縱子半位點(diǎn)，載體帶有

10、大觀霉素的抗性基因，另外在AraC上游插入4個(gè)串聯(lián)的rrnB終止子，減小轉(zhuǎn)錄通讀對(duì)報(bào)告基因活性的背景影響。此3載體共表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)是誘餌蛋白同捕獲蛋白分別獨(dú)立誘導(dǎo)，可以通過(guò)控制誘導(dǎo)物的濃度逐步放大雜交蛋白相互作用對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的抑制效應(yīng)。誘餌蛋白與捕獲蛋白分別結(jié)合在上游和下游的2個(gè)操縱子上，如果二者可以發(fā)生雜交作用，則在報(bào)告基因的DNA鏈上形成突環(huán)，使AraC轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，所以通過(guò)菌落的藍(lán)白斑差異可以篩選出發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)。1.5 Univector系統(tǒng)通常在構(gòu)建重組子表達(dá)時(shí)需要依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶的作有，進(jìn)行亞克隆，而利用同源重組開(kāi)發(fā)的載體可以實(shí)現(xiàn)基因的一次性克隆。Unive

11、ctor表達(dá)系統(tǒng)(UPS)就是這方面較為成功的實(shí)例16。Univector系統(tǒng)由兩類載體組成(圖1):一種稱為萬(wàn)能的進(jìn)入載體pUN1,具有特殊的loxP重組序列，通過(guò)重組酶Cre可以方便地穿梭進(jìn)入表達(dá)載體；另一種即表達(dá)載體pHOST,同樣具有l(wèi)oxP序列，pHOST是由不同的啟動(dòng)子與融合標(biāo)簽組成的載體系列，便于高通量篩選蛋白產(chǎn)物。Univector系統(tǒng)的特點(diǎn)是平行獨(dú)立克隆到多載體中，使之在不同的誘導(dǎo)條件下表達(dá)，大大提高了表達(dá)的成功率，尤其在蛋白組的研究中具有很大的應(yīng)用潛力網(wǎng)。2宿主細(xì)胞在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因的主要優(yōu)勢(shì)：一個(gè)是宿主的遺傳背景比較清楚，易于控制基因的表達(dá)；另一個(gè)是大腸桿菌容易

12、培養(yǎng)，可以獲得較高產(chǎn)量的目的蛋白。但是在商業(yè)應(yīng)用中很多的蛋白產(chǎn)物是真核基因編碼，并且具有高級(jí)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，要求翻譯后加工為正確的折疊形式或者糖基化蛋白等。由于大腸桿菌細(xì)胞的分子環(huán)境和折疊機(jī)制等與真核細(xì)胞具有很大的差異，所以在應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)真核基因時(shí)有必要利用代謝工程或進(jìn)化的方法改造細(xì)胞，解決大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的局限性，提高產(chǎn)物的活性。2. 1代謝工程載體攜帶目的基因進(jìn)入宿主表達(dá)會(huì)給宿主本身造成代謝上的負(fù)擔(dān)，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速率等，推測(cè)可能是因?yàn)樗拗鞑荒芴峁┳銐蛲庠椿虮磉_(dá)所需的原料及能量。減輕表達(dá)對(duì)于宿主的壓力可以通過(guò)控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)或者改變載體的抗性基因，還可以將目的基因直接插入染色體中

13、表達(dá)。Flores等則是將磷酸戊糖途徑的代謝關(guān)鍵酶一6磷酸葡萄糖脫氫酶的基因克隆到多拷貝質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌使細(xì)胞的生長(zhǎng)速率在誘導(dǎo)后得到恢復(fù)17。除了利用大腸桿菌的代謝機(jī)制改進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)，另外還可以人為地在大腸桿菌中設(shè)計(jì)代謝途徑，例如Masip等設(shè)計(jì)的二硫鍵合成途徑。在大腸桿菌中催化二硫鍵形成的是周質(zhì)蛋白DsbA,此蛋白通過(guò)膜蛋白DsbB得到循環(huán)利用。Masip等選擇硫氧化還原蛋白TrxA作為二硫鍵的供體，使之在氧化態(tài)的胞質(zhì)內(nèi)形成二硫鍵，通過(guò)融合Tat特異性前導(dǎo)肽從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)使重組蛋白在周質(zhì)獲得二硫鍵。因此這一途徑不依賴DsbADsbS體系，僅通過(guò)胞內(nèi)的硫氧化還原蛋白就能形成二硫鍵，所以可

14、以修復(fù)缺失DsbADsbB體系的宿主18。2. 2定向進(jìn)化通常重組蛋白對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶都很敏感，為了避免蛋白酶的作用除了分泌表達(dá)外還可以對(duì)相關(guān)的蛋白酶進(jìn)行突變，例如篩選缺乏ATP依賴的胞內(nèi)蛋白酶的菌株，但是對(duì)于是否細(xì)胞因此而上調(diào)其它的蛋白酶濃度還不清楚。另外在周質(zhì)中的蛋白酶也會(huì)降解產(chǎn)物蛋白，DegP蛋白是存在于細(xì)胞周質(zhì)中的主要蛋白酶，所以可以應(yīng)用degP失活的宿主表達(dá)蛋白。同時(shí)，C端為非極性的蛋白應(yīng)該在prc突變的宿主中表達(dá)(Prc蛋白酶作用于C端非極性的蛋白)，或者以N端融合形式表達(dá)19。前文已經(jīng)提到過(guò)選擇分子伴侶的問(wèn)題，利用定向進(jìn)化的方法分離分子伴侶或折疊因子的變異體，可以針對(duì)重組蛋白進(jìn)

15、行高效的特異性折疊。Weissman等對(duì)大腸桿菌進(jìn)行多輪的DNA改組和篩選，分離出的GroEL突變體提高了對(duì)綠色熒光蛋白的折疊效率20。另外，定向進(jìn)化的方法還可以擴(kuò)大大腸桿菌的遺傳密碼，在蛋白中添加非天然的氨基酸。決定氨酰tRNA合酶催化tRNA攜帶正確氨基酸的因素是不同于氨?；稽c(diǎn)的一個(gè)編輯位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)染色體的隨機(jī)誘變，篩選出一類突變體可以催化tRNAVal結(jié)合Ser,并且20%ffl胞內(nèi)的Val都被類似于Ser的氨基丁酸取代21。Schultz等向大腸桿菌中引入一對(duì)特殊的tRNA/氨酰tRNA合酶，摻入對(duì)琥珀密碼子應(yīng)答的甲基化酪氨酸，在表達(dá)二氫葉酸還原酶的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于非天然氨基酸的存在

16、使基因翻譯的保真度達(dá)到99需2。2.3蛋白質(zhì)的糖基化很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，大腸桿菌被認(rèn)為不能表達(dá)糖基化蛋白，因?yàn)樵思?xì)胞普遍缺乏糖基化功能。而在真核細(xì)胞中，大多數(shù)分泌蛋白都在翻譯后加工過(guò)程中獲得N端的寡糖鏈。寡糖(Glc3Man9GlcAc2)被類脂運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白的N端，由寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶催化寡糖與天冬酰氨或絲氨酸/蘇氨酸殘基形成N連接或O連接?？漳c彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有類似真核糖基化代謝功能的原核生物，其基因組中的pgl基因簇編碼的蛋白類似于真核細(xì)胞中的糖基轉(zhuǎn)移酶。Wacker等將空腸彎曲桿菌的糖基化基因克隆到大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果pgl編碼的蛋白PglB可

17、以指導(dǎo)質(zhì)粒編碼的AcrA蛋白的糖基化。通過(guò)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌與真核細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白在寡糖鏈組成上沒(méi)有相似性，但是同樣與AsnXaaSer/Thr的氨基酸殘基結(jié)合23。Schultz等將進(jìn)化突變的方法應(yīng)用于蛋白的翻譯后加工中，結(jié)果獲得了高產(chǎn)率的糖基化的肌紅蛋白。他們從甲烷球菌中分離出酪氨酸t(yī)RNA合酶TyrRSs基因，在活性位點(diǎn)進(jìn)彳T隨機(jī)突變，經(jīng)過(guò)幾輪陽(yáng)性和陰性篩選后得到對(duì)3-乙酰氨基葡萄糖-絲氨酸具有特異性的TyrRSs。這種氨酰tRNA合酶可以對(duì)琥珀密碼子TAG應(yīng)答催化形成tRNATyr3GlcNAc又;3GlcNAc的摻入為蛋白的糖基化提供了初級(jí)的糖基化位點(diǎn)，可以被糖基轉(zhuǎn)運(yùn)酶識(shí)

18、別進(jìn)一步合成復(fù)雜的糖鏈。這種方法也可以應(yīng)用于其它的翻譯后加工中，包括蛋白的甲基化、磷酸化、乙?；?4。基因的表達(dá)過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后加工、細(xì)胞的代謝以及細(xì)胞內(nèi)基因與蛋白、蛋白與蛋白之間的相互作用。進(jìn)入后基因時(shí)代之后，大腸桿菌首先被選作研究蛋白組學(xué)、基因功能、蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)等新課題的模型，揭示了很多基因表達(dá)的未知領(lǐng)域，同時(shí)提供了更多發(fā)展大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的依據(jù)。伴隨分子生物學(xué)新技術(shù)的涌現(xiàn)，大腸桿菌勢(shì)必在實(shí)驗(yàn)研究及工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的應(yīng)用中發(fā)揮出更大的作用。參考文獻(xiàn)1 ReedJL,PalssonB.ThirteenYearsofBuildingConstraintBase

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