科研訓(xùn)練論文1

1、單位代碼：10226學(xué)號：2009172057分類號： 2009172033 2009172075哈爾濱醫(yī)科大學(xué)七年制學(xué)生基礎(chǔ)階段科研訓(xùn)練論文題 目 ： 聲動力治療巨噬細(xì)胞通過促進(jìn)ATP釋放趨化單核細(xì)胞 學(xué)科、專業(yè) ： 病理生理學(xué)教研室 學(xué) 生 姓 名： 曹博然 張翰 趙雪竹 指 導(dǎo) 教 師： 田野 教授 指 導(dǎo) 研 究 生： 孫鑫 郭淑媛 陳海波 二一二年七月目 錄目 錄1中文摘要2Abstract3文獻(xiàn)綜述5前 言12材料與方法13技術(shù)路線15結(jié) 果16討 論19結(jié) 論21致 謝21參考文獻(xiàn)22中文摘要目 的：證明聲動力治療(sonodynamic therapy,SDT)巨噬細(xì)胞能夠趨化

2、單核細(xì)胞的聚集并探討其機(jī)制。方 法：將實驗對象分為對照組、SDT組、ATPase組及SDT-ATPase組。其中對照組為單純THP-1源性巨噬細(xì)胞，而SDT組是在對照組基礎(chǔ)上加入終濃度為15g/ml的5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid, ALA），孵育2小時后接受聲動力治療。ATPase組及SDT-ATPase組則是分別在對照組和SDT組基礎(chǔ)上加入ATPase。將實驗對象離心后取其細(xì)胞上清液并分別用transwell方法研究其對單核細(xì)胞的趨化作用；將實驗對象分為對照組、SDT組、zVAD-fmk組及SDT-zVAD組。其中對照組為單純THP-1源性巨噬細(xì)胞，SDT組是在

3、對照組基礎(chǔ)上加入 ALA，孵育2小時后接受聲動力治療。zVAD-fmk組及SDT-zVAD組則是分別在對照組和SDT組基礎(chǔ)上加入N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮(zVAD-fmk)。將實驗對象離心后，分別用熒光素酶方法檢測細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)ATP量的變化。結(jié) 果：用transwell方法研究聲動力治療后的細(xì)胞上清對單核細(xì)胞的趨化作用時，從募集的單核細(xì)胞數(shù)量來看，聲動力治療組明顯高于對照組（p<0.05），加入ATPase并進(jìn)行聲動力治療組與聲動力治療組相比顯著降低，對照組與ATPase組無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；用熒光素酶方法，檢測聲動力治療巨噬細(xì)胞后及加入

4、凋亡抑制劑后細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)ATP量的變化得出：聲動力治療組明顯高于對照組，約為其3倍（p<0.05）；加入zVAD-fmk并進(jìn)行聲動力治療組較聲動力組顯著降低；對照組與zVAD-fmk無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。 結(jié) 論：聲動力治療巨噬細(xì)胞通過促進(jìn)凋亡相關(guān)的ATP釋放趨化單核細(xì)胞 關(guān)鍵詞：ATP 動脈粥樣硬化 聲動力療法 巨噬細(xì)胞AbstractPurpose: This paper is designed to investigate the effects of monocytes recruitment after sonodynamic therapy and delv

5、e into its mechanism.Methods: The subjects were divided into four groups: The control group,the SDT group, the ATPase group and the SDT-ATPase group.The control group merely contains THP-1 derived macrophages.The SDT one,containing macrophages and sonosensitizer ALA ,was incubated with fresh medium

6、for 6 h before being exposed to pulse ultrasound irradiation. The ATPase group was a mixture of the control group and ATPase. Similarly,the SDT-ATPase group , was comprised of the SDT group and ATPase. Cell-free supernatants from each group were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes

7、in a transwell migration assay.For a further study of ATP concentrations changes, we use another four groups of subjects: The control group(macrophages alone),the SDT group, the zVAD-fmk group(added caspase-inhibitor zAVD-fmk ) and the SDT-zAVD group（like the SDT group pretreated with zAVD-fmk）.Supe

8、rnatants and cell debris after high speed centrifugation from these four groups were investigated respectively.Results: Cell-free supernatants with SDT were assessed for their ability to attract THP-1 monocytes in a transwell migration assay. The SDT group induced an approximately sixfold greater re

9、cruitment of monocytes than the control group did(p<0.05), while the monocytes migration of the SDT-ATPase group decreased significantly compared to the SDT group.Besides, there was no statistic difference between the control group and the ATPase group(p>0.05). Luminometer was used to measure

10、the change of ATP content.The ATP concentration of the SDT group was increased about therefold in comparison with the control group (p<0.05),and the SDT-zAVD group had a distinct decrease compared with the SDT group. The control group and the zVAD-fmk group showed no statistic difference(p>0.0

11、5).Conclusions: This study demonstrates that SDT could induce the recruitment of monocytes by promoting the release of ATP in THP-1 macrophages via caspase-dependent pathway .Key words: ATP, atherosclerosis, sonodynamic therapy, macrophages文獻(xiàn)綜述 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種多因性疾病，近年來，盡管AS的診斷與治療有了長足的進(jìn)

12、步，但人們對其病因?qū)W的認(rèn)識仍然不足。既往和晚近提出的AS發(fā)病學(xué)說，如血栓形成學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、單克隆學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說、剪切應(yīng)力學(xué)說、同型半胱氨酸學(xué)說、精氨酸學(xué)說、內(nèi)皮功能紊亂學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等都不足以完全解釋AS的發(fā)病基礎(chǔ)1。近年來的基礎(chǔ)研究與臨床研究結(jié)果提示，AS炎癥學(xué)說應(yīng)重新受到重視。有充分的證據(jù)顯示，在AS性疾病的不同臨床表現(xiàn)形式中，炎癥參與其發(fā)生和發(fā)展的所有環(huán)節(jié)2。這一發(fā)現(xiàn)，為臨床治療AS提供了理論依據(jù)及研發(fā)新藥提供了新思路。1. 巨噬細(xì)胞凋亡與動脈粥樣硬化近年的研究表明，動脈粥樣硬化病灶內(nèi)脂質(zhì)中心的大小、炎細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞的數(shù)量、纖維帽的厚薄及新生血管的多少是決定斑塊穩(wěn)定與否

13、的最主要的因素，而巨噬細(xì)胞則通過對斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量、炎癥反應(yīng)、纖維成分的降解及新血管形成等方面來影響動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展，從脂質(zhì)條紋的發(fā)生到最終斑塊破裂和血栓形成，巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化的所有階段都起著極其重要的作用。1.1巨噬細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化不同病變階段的機(jī)制及作用近年來，細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化的形成和進(jìn)展中的作用日漸成為研究熱點(diǎn)，斑塊破裂伴血栓形成是造成動脈粥樣硬化臨床急性癥狀的主要原因，而大量的細(xì)胞凋亡直接造成斑塊不穩(wěn)定3，凋亡過度是不穩(wěn)定斑塊的明顯特征。據(jù)相關(guān)報道，在斑塊的不同區(qū)域凋亡率具有一定的差別，富含巨噬細(xì)胞區(qū)細(xì)胞凋亡通常要高于其他區(qū)域4。斑塊的“肩部”最容易發(fā)生破裂，纖維

14、帽薄，含有大量激活的巨噬細(xì)胞，并存在凋亡殘體及許多內(nèi)含凋亡細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，凋亡細(xì)胞和凋亡殘體對巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)烈的化學(xué)趨化活性，而巨噬細(xì)胞本身也遭受細(xì)胞凋亡所釋放的細(xì)胞因子的影響而發(fā)生凋亡。巨噬細(xì)胞的吞噬作用在動脈粥樣硬化不同的病變階段有著很大的差異，所以在病變早期和晚期其凋亡對動脈粥樣硬化的影響是不同的。在病變早期，巨噬細(xì)胞吞噬功能很強(qiáng)，主要針對脂蛋白，也可有效清除凋亡細(xì)胞，其表達(dá)的TG2不但能促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除，而且能限制活體內(nèi)動脈粥樣硬化病變的大小5，因此，動脈粥樣硬化早期巨噬細(xì)胞凋亡可減少病變成分而抑制病變進(jìn)展6。巨噬細(xì)胞能表達(dá)多種清道夫受體(scavenger recepto

15、r, SR)，包括SR-A、SR-BI、CD36、CD68及SR-E(LOX-1)等，它遷入內(nèi)膜后能通過其表面的SR攝取氧化修飾后的脂蛋白，絕大多數(shù)脂蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中消化并降解為氨基酸和游離膽固醇，過多的游離膽固醇以膽固醇酯的形式儲存在胞質(zhì)里，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞7。粥樣壞死中心的形成與泡沫細(xì)胞的聚集和凋亡密切相關(guān)。研究表明，斑塊脂質(zhì)中心有巨噬細(xì)胞抗體CD68的表達(dá)，說明壞死物中有巨噬細(xì)胞的殘片，這也間接支持粥樣壞死中心是在泡沫細(xì)胞聚集凋亡的基礎(chǔ)上形成的。而且，斑塊中的脂質(zhì)越多，其纖維帽中的巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞也越多，說明粥樣壞死可能在單核細(xì)胞向內(nèi)膜遷入過程中起一定的促進(jìn)作用。在成熟病變中，

16、吞噬細(xì)胞吞噬血小板、紅細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及脂蛋白，其中對凋亡細(xì)胞的吞噬有利于斑塊的穩(wěn)定，清除凋亡細(xì)胞的能力可能對急性粥樣血栓性臨床事件起決定作用6。但晚期病變中，許多因素可引起吞噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞的功能受損，導(dǎo)致斑塊內(nèi)壞死、炎癥及血栓形成8。斑塊中細(xì)胞大量凋亡不僅直接造成脂質(zhì)中細(xì)胞數(shù)量的減少，而且由于巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡后形成的凋亡物質(zhì)難以清除，發(fā)生繼發(fā)性壞死和炎癥反應(yīng)，細(xì)胞膜完整性破壞，脂質(zhì)為主的胞漿內(nèi)容物釋放后堆積形成脂質(zhì)池，從而促進(jìn)斑塊脂質(zhì)中心的形成并逐漸增大。因此，在動脈粥樣硬化晚期，巨噬細(xì)胞的凋亡對斑塊的穩(wěn)定是不利的。加強(qiáng)巨噬細(xì)胞整體的吞噬功能并非完全有益，然而選擇性加強(qiáng)其對凋亡細(xì)胞

17、的攝取，可能有助于動脈粥樣硬化病變的抑制。1.2斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡與血管平滑肌細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系在動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都經(jīng)歷著凋亡與壞死，而凋亡占主導(dǎo)地位。血管平滑肌細(xì)胞分散于粥樣病灶內(nèi)皮下纖維部分及斑塊纖維帽深部中膜的下層，而巨噬細(xì)胞成簇分布于內(nèi)皮下、富含脂質(zhì)的病灶中心和纖維帽的肩部。因此，平滑肌細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的凋亡主要發(fā)生在纖維區(qū)，而巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的凋亡主要發(fā)生在病變的脂質(zhì)核心處，后者比前者更易發(fā)生凋亡，特別是在脂質(zhì)核內(nèi)和脂質(zhì)核周圍，在脂質(zhì)核的非細(xì)胞部分可發(fā)現(xiàn)其凋亡殘留物。平滑肌細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞凋亡對動脈粥樣硬化病變的意義不同，在斑塊易損部位平滑肌細(xì)胞凋

18、亡能引起纖維帽的強(qiáng)度減弱，平滑肌細(xì)胞凋亡只是斑塊破裂的一個征兆，并非會直接導(dǎo)致斑塊破裂，平滑肌細(xì)胞凋亡不可能通過纖維帽變薄來促進(jìn)斑塊破裂9。有研究報道，巨噬細(xì)胞分泌的Fas配體可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡10，而血管平滑肌細(xì)胞凋亡也可增加巨噬細(xì)胞凋亡，由于這能減少巨噬細(xì)胞因過度表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)而對細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，所以有利于斑塊的穩(wěn)定11。1.3巨噬細(xì)胞與動脈粥樣硬化的治療動脈粥樣硬化是多因素作用的復(fù)雜病變，在其發(fā)生發(fā)展中巨噬細(xì)胞有著重要的作用，抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集、減輕炎癥反應(yīng)，以及選擇性調(diào)控其凋亡程序?qū)⒊蔀閯用}粥樣硬化新的有效的治

19、療手段。目前臨床上已有多種對抗動脈粥樣硬化的治療方法，如降脂治療、他汀類藥物的應(yīng)用及血管源性細(xì)胞活素療法等，都直接或間接地影響著巨噬細(xì)胞的凋亡。相信，隨著蛋白組學(xué)和基因芯片等技術(shù)的逐步完善，我們將會對動脈粥樣硬化中巨噬細(xì)胞的凋亡進(jìn)行更有利的調(diào)控，從而使動脈粥樣硬化有更好更廣闊的臨床治療前景。 2. 聲動力治療 2.1聲動力治療的概況 1989年國際超聲學(xué)會議上，日本學(xué)者Umemura S首次提出了SDT這一概念。SDT是指對腫瘤患者靜脈注射聲敏劑后，應(yīng)用一定頻率和強(qiáng)度超聲作用于腫瘤部位，使聚集在腫瘤部位聲敏劑產(chǎn)生抗腫瘤因子從而對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，抑制腫瘤的進(jìn)一步生長。SDT有其獨(dú)特的優(yōu)越性：無

20、創(chuàng)性、超聲治療裝置簡單易操作、靶向治療、特異性強(qiáng)、副作用小。 2.2聲動力治療的機(jī)制SDT作用機(jī)制目前仍不清楚，主要的有超聲空化效應(yīng)、自由基理論、單線態(tài)氧機(jī)制等。 2.2.1超聲空化效應(yīng)超聲空化效應(yīng)是指液體中的微小氣泡(空穴) 在聲波作用下所發(fā)生的振蕩、擴(kuò)大、收縮乃至崩潰等一系列動力學(xué)過程，從而產(chǎn)生如化學(xué)反應(yīng)、發(fā)光、次諧波等現(xiàn)象。 2.2.2自由基理論自由基理論認(rèn)為由于超聲的空化作用激活空化泡內(nèi)或臨近的光敏劑，通過直接熱分解弱鍵或與水熱分解形成的·H 和·OH 反應(yīng)產(chǎn)生光敏劑來源的自由基，自由基與O2 反應(yīng)形成烷氧自由基和過氧基對有機(jī)溶液中的有機(jī)分子反應(yīng)活性低,更容易到達(dá)靶

21、細(xì)胞而發(fā)揮作用14。2.2.3單線態(tài)氧機(jī)制超聲過程中超聲空化導(dǎo)致聲致發(fā)光，光激活空化泡內(nèi)或臨近的光敏劑分子而產(chǎn)生單線態(tài)氧。 O2 具有細(xì)胞毒性作用，其較大的擴(kuò)散半徑,能穿透線粒體膜,參與電子傳遞和氧化作用；能穿透核膜，造成DNA 的損傷；導(dǎo)致胞膜脂質(zhì)過氧化而殺傷細(xì)胞等。2.3聲敏劑目前研究中所使用的聲敏劑主要分為三類15：卟啉類化合物、抗炎藥物、抗癌癥藥物。理想的聲敏劑不但要求化學(xué)純性、有效的聲敏化作用，還要對靶組織有較好的選擇性，對人體毒副作用小，可以迅速的從體內(nèi)排除等，目前認(rèn)為較好的聲敏劑仍是以卟啉類為主。卟啉類化合物作為聲敏劑用于臨床診斷和治療惡性腫瘤已有20多年，其能在腫瘤部位聚集，卟

22、啉由通過超聲產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移給電子而激發(fā)，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的自由基。ALA 屬于第二代光敏劑。與其他光敏劑相比，具有光毒性副作用小，用藥后避光時間短，滲透性好，對組織深層病變的療效和選擇性更佳等優(yōu)點(diǎn)，成為目前光動力治療領(lǐng)域研究的方向和熱點(diǎn)。ALA是一簡單的五碳化合物，多以鹽酸鹽形式存在。分子式為C5H9NO3·HCl，為白色或微黃色針狀結(jié)晶或粉末， 能溶于水和乙醇，極微溶于乙醚和乙酸乙酯。它是人體血紅素代謝的內(nèi)源性前體物質(zhì)， 體內(nèi)代謝途徑見圖116。ALA在各種酶的激活下生成原卟啉(Pp)，原卟啉是血紅素內(nèi)源性合成代謝途徑中的一種前體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖222所示。細(xì)胞內(nèi)的Pp是一種很強(qiáng)的

23、光敏物質(zhì)，最大吸收峰值位于630 nm，光敏毒副反應(yīng)小，是重要的光動力治療藥物。Pp是一種非常有效的光敏劑，它在一定波長的光照射下，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)， 產(chǎn)生單重態(tài)氧和氧化物， 引起細(xì)胞膜、線粒體和核酸的損傷，使病變細(xì)胞壞死、凋亡，從而起到治療疾病的作用17。圖1 ALA體內(nèi)代謝途徑Fig1.The metabolic pathway of ALA in vivoB圖2. 聲敏劑分子結(jié)構(gòu) A. ALA B. 原卟啉IXFig. 2 Molecular structure of sonosensor A. ALA B.protoporphyrin IX A2.4聲動力治療與動脈粥樣硬化斑塊 1989

24、年Umemura 等通過在體和細(xì)胞的實驗研究表明，血卟啉介導(dǎo)的超聲治療比單純的超聲誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死明顯增多，由此首次提出了聲動力治療的概念18。其機(jī)理可能是主要地與超聲的空化作用激活聚集在癌組織的血卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧，引起病變組織細(xì)胞的壞死和凋亡。2002年Arakawa K等研究了聲動力治療用于兔股動脈置入支架后再狹窄預(yù)防作用19，而聲動力治療對動脈粥樣硬化斑塊的作用的研究目前國內(nèi)外未見報道。 3. ATP 三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）是一種核苷酸，作為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學(xué)能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。 3.1 機(jī)體內(nèi)AT

25、P生物學(xué)作用 三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）是一種核苷酸，作為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，儲存和傳遞化學(xué)能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。人體中ATP的總量只有大約0.1摩爾。人體每天的能量需要水解100-150摩爾的ATP即相當(dāng)于50至75千克。這意味著人一天將要分解掉相當(dāng)于他體重的ATP。所以每個ATP分子每天要被重復(fù)利用1000-1500次。ATP不能被儲存，因為ATP的合成后必須在短時間內(nèi)被消耗。 ATP還可作為能源物質(zhì)。肌肉中儲藏著多種能源物質(zhì)，主要有三磷酸腺苷（ATP）、磷酸肌酸（CP）、肌糖原、脂肪等。 ATP亦參與能源物質(zhì)的代謝：（一

26、）無氧代謝：劇烈運(yùn)動時，體內(nèi)處于暫時缺氧狀態(tài)， 在缺氧狀態(tài)下體內(nèi)能源物質(zhì)的代謝過程，稱為無氧代謝。它包括以下兩個供能系統(tǒng)。 非乳酸能（ATPCP）系統(tǒng)一般可維持10秒肌肉活動 無氧代謝 乳酸能系統(tǒng)一般可維持13分的肌肉活動 非乳酸能（ATPCP）系統(tǒng)和乳酸能系統(tǒng)是從事短時間、 劇烈運(yùn)動肌肉供能的主要方式。ATP釋放能量供肌肉收縮的時間僅為13秒， 要靠CP分解提供能量，但肌肉中CP的含量也只能夠供ATP合成后 分解的能量維持68秒肌肉收縮的時間。因此， 進(jìn)行10秒以內(nèi)的快速活動主要靠ATPCP系統(tǒng)供給肌肉收縮時的能量。 乳酸能系統(tǒng)是持續(xù)進(jìn)行劇烈運(yùn)動時，肌肉內(nèi)的肌糖元在缺氧狀態(tài)下進(jìn)行酵解， 經(jīng)過

27、一系列化學(xué)反應(yīng)，最終在體內(nèi)產(chǎn)生乳酸，同時釋放能量供肌肉收縮。 這一代謝過程，可供13分左右肌肉收縮的時間。 (二)有氧代謝：是在氧充足的條件下，肌糖元或脂肪徹底氧化分解，最終生成二氧化碳(Co2)和水(H2O)， 同時釋放大量的分解代謝，稱為有氧氧化系統(tǒng)。 3.2 ATP與“find-me”信號 人體內(nèi)每一天都會更新數(shù)以億計的細(xì)胞，而這種快速的、有效地、免疫的清除死亡細(xì)胞的方式需要通過吞噬細(xì)胞選擇性識別、吞噬凋亡細(xì)胞來實現(xiàn)。近期研究表明一類由凋亡細(xì)胞釋放的可溶性介質(zhì)在趨化吞噬細(xì)胞中起到了重要作用，而這種介質(zhì)我們稱之為“find-me”信號。這些信號包括溶血磷脂酰膽堿、趨化因子、ATP、UTP、

28、S1p等等。其中ATP等確認(rèn)可以在體內(nèi)環(huán)境下，起到對單核細(xì)胞的吸引作用，因此“find-me”信號這一概念證實了凋亡細(xì)胞確實對趨化吞噬細(xì)胞有積極地作用12。3.3 ATP與caspase凋亡細(xì)胞釋放核苷酸依賴于caspase途徑的調(diào)節(jié)功能。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡之前加入caspase抑制劑zVAD-fmk后所取上清液不能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞聚集，證明凋亡細(xì)胞釋放的ATP依賴于caspase途徑并受其調(diào)節(jié)13。 前 言動脈粥樣硬化是一種與多種危險因素有關(guān)的復(fù)雜疾病，炎癥是其發(fā)生發(fā)展重要的病理生理機(jī)制之一，炎癥細(xì)胞在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)大量浸潤會導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定，而不穩(wěn)定斑塊的破裂恰恰是許多急性心血管事件的觸發(fā)點(diǎn)

29、。聲動力治療是通過超聲誘導(dǎo)聲敏劑來殺傷細(xì)胞的新方法，但是在聲動力治療巨噬細(xì)胞后死亡的巨噬細(xì)胞及斑塊內(nèi)堆積的脂質(zhì)需要趨化更多的單核細(xì)胞進(jìn)入斑塊進(jìn)行清除，才能達(dá)到改善斑塊內(nèi)的炎癥環(huán)境的目的。本研究用transwell方法證明聲動力治療后的巨噬細(xì)胞上清能夠趨化單核細(xì)胞，而且這種趨化能夠被ATP酶部分的抑制。用熒光素酶法，證明聲動力治療巨噬細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)及釋放到上清中的ATP增多，而在抑制了caspase途徑凋亡后，這種增多的趨勢減弱。本研究驗證了聲動力治療巨噬細(xì)胞能夠趨化單核細(xì)胞，并探討了ATP在趨化過程中的作用，對聲動力治療動脈粥樣硬化的機(jī)制進(jìn)行了有益的探索，并為動脈粥樣硬化的治療提示了一個可能的新

30、方向。材料與方法1. 實驗對象THP-1,人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系， 中科院上海細(xì)胞庫2. 試劑與儀器2.1主要試劑 5-氨基酮戊酸（ALA） 天豐生物科技有限公司，西安牛胎血清，RMPI1640培養(yǎng)基Hyclone化學(xué)公司，北京青霉素G，鏈霉素 Beyotime生物技術(shù)，江蘇12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽（PMA） Darmstad公司，德國ATP檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司， 上海ATP酶 碧云天生物技術(shù)有限公司，上海臺盼藍(lán) 碧云天生物技術(shù)有限公司， 上海N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮(zVAD-fmk)BioVision公司，美國2.2主要儀器Trans

31、well Corning公司，美國Luminometer Thermo 公司，美國3.5cm細(xì)胞培養(yǎng)皿 Corning公司，美國IX 71型熒光顯微鏡 Olympus公司，日本3. 實驗方法3.1 細(xì)胞培養(yǎng)THP-1（人急性單核白血病細(xì)胞系）作為實驗用細(xì)胞系。使用添加有10%胎牛血清和50g/ml的青霉素G-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基孵育THP-1細(xì)胞。將培養(yǎng)基保存在37、含5%CO2和95%空氣的保濕孵育器內(nèi)，當(dāng)發(fā)生聚集時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實驗時，將細(xì)胞以每孔1x105的數(shù)目植入3.5cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，并加入添加有濃度為10g/ml PMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時即成為巨噬細(xì)胞。3.2 SDT治療

32、向3.5cm培養(yǎng)皿內(nèi)的巨噬細(xì)胞加入終濃度為15g/ml的ALA，孵育2小時后，用頻率為1MHz，強(qiáng)度為0.8W/cm2的超聲輻照5 min,之后以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩次，加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3.3 Transwell取SDT后6小時細(xì)胞上清、對照組細(xì)胞上清、ATPase組及SDT-ATPase組細(xì)胞上清，分別加入transwell板下層， 并在transwell板的小室內(nèi)加入密度為106/ml的單核細(xì)胞，繼續(xù)在胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后，對下層細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，用顯微鏡拍照后統(tǒng)計下層細(xì)胞數(shù)。3.4 熒光素酶法檢測細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)ATP 取SDT后20min、對照組、zVAD-f

33、mk組及SDT&zVAd-fmk 組細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液，分別加入配置好的ATP檢測工作液當(dāng)中，反應(yīng)10s后使用luminometer分別檢測細(xì)胞上清液及胞內(nèi)ATP含量。4. 統(tǒng)計分析各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，P 0.05 為差異有意義。技術(shù)路線THP-1巨噬細(xì)胞細(xì)胞裂解產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶細(xì)胞上清液LuminometerSDT組SDT -zVAD組對照組THP-1 巨噬細(xì)胞對照組 SDT- ATPase組 ATPaseATPase細(xì)胞上清液 ATP酶組SDT組Transwell zVAD-fmk組結(jié) 果1. 培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞并

34、將其誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，見圖3 A B圖3 A THP-1單核細(xì)胞 B 巨噬細(xì)胞 （200X） 2. Transwell方法測定細(xì)胞上清液對單核細(xì)胞趨化作用，見圖4 A B C圖4 A Transwell實驗?zāi)Ｊ綀D B 用光學(xué)顯微鏡觀察募集的臺盼藍(lán)染色后的單核細(xì)胞，并計數(shù) C 細(xì)胞遷移數(shù) （*：P<0.05;#：P>0.05）從募集的單核細(xì)胞數(shù)量來看，聲動力治療組明顯高于對照組，P<0.05；加入ATPase并進(jìn)行聲動力治療組與聲動力治療組相比顯著降低，對照組與ATPase組無統(tǒng)計學(xué)差異。3 熒光素酶法測定上清及細(xì)胞內(nèi)ATP含量，見圖5AB圖5 A ATP濃度與熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線

35、B 各組ATP濃度(*:P<0.05;#:P>0.05)聲動力治療后的ATP濃度明顯高于對照組，約為其3倍；加入zVAD-fmk并進(jìn)行聲動力治療組較聲動力組顯著降低；對照組與zVAD-fmk無統(tǒng)計學(xué)差異；SDT-zVAD組與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。BA DC 討論動脈粥樣硬化目前已經(jīng)成為了全球范圍內(nèi)，人類健康的嚴(yán)重威脅20,21。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致易損斑塊破裂的主要因素22，因此在動脈粥樣硬化進(jìn)展中對巨噬細(xì)胞積極性干預(yù)，對于預(yù)防急性心血管事件的發(fā)生具有非常重要的臨床意義。有研究認(rèn)為，在斑塊早期，因單核吞噬系統(tǒng)對凋亡巨噬細(xì)胞清除能力正常，不會出現(xiàn)繼發(fā)性的炎癥反應(yīng)和壞死；而隨著病

36、變的進(jìn)展，單核吞噬系統(tǒng)對凋亡壞死物的吞噬清除功能發(fā)生障礙23，導(dǎo)致斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，脂質(zhì)壞死核心擴(kuò)大，誘發(fā)斑塊破裂、血栓形成，引發(fā)急性心血管事件。在這個過程中，凋亡細(xì)胞釋放的一系列信號，包括“find-me”、“keep-out” 、“dont-eat-me”和“come-get-me”信號等，能夠調(diào)節(jié)單核性吞噬細(xì)胞的趨化活性和吞噬功能。目前有研究表明，凋亡細(xì)胞釋放的核苷酸可以作為一種“find-me”信號參與對單核性吞噬細(xì)胞的募集13。為了驗證SDT治療巨噬細(xì)胞后對單核細(xì)胞趨化的效果以及凋亡細(xì)胞釋放的核苷酸作為“find-me”信號的趨化功能，我們進(jìn)行了一系列實驗。首先，我們采用trans

37、well 趨化性實驗證明聲動力治療后的凋亡巨噬細(xì)胞能夠趨化單核性吞噬細(xì)胞，并且初步驗證核苷酸能夠作為一種“find-me”信號（從實驗室現(xiàn)有藥品及可行性出發(fā)，我們初步選定ATP作為驗證對象）。取SDT后6小時細(xì)胞上清、對照組細(xì)胞上清、ATPase組及SDT-ATPase組，分別加入transwell板下層， 并在transwell板的小室內(nèi)加入密度為106/ml的單核細(xì)胞，繼續(xù)在胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h后，對下層細(xì)胞進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，用顯微鏡拍照后統(tǒng)計下層細(xì)胞數(shù)。SDT組較對照組單核細(xì)胞數(shù)顯著增加。此實驗結(jié)果證實聲動力治療后的凋亡巨噬細(xì)胞能夠趨化單核細(xì)胞的聚集。而SDT-ATPase組較對照組顯著下

38、降說明ATP可能作為一種“find-me”信號在凋亡巨噬細(xì)胞趨化單核細(xì)胞的過程中起到一定的作用。 為進(jìn)一步驗證ATP為凋亡細(xì)胞釋放的一種“find-me”信號，我們使用luminometer測定聲動力治療后ATP濃度。取SDT后20min、對照組、zVAD-fmk組及SDT-zVAd 組細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液，分別加入配置好的ATP檢測工作液當(dāng)中，反應(yīng)10s后使用luminometer分別檢測細(xì)胞上清液及胞內(nèi)ATP含量。SDT組明顯高于對照組，而SDT-zVAd組較SDT組顯著降低。本實驗證明聲動力治療后的凋亡巨噬細(xì)胞促進(jìn)ATP的釋放，從而趨化單核細(xì)胞的聚集；而且ATP的釋放與caspase途徑

39、依賴的凋亡有關(guān)。 綜上所述，本實驗證明了聲動力治療巨噬細(xì)胞通過促進(jìn)ATP釋放趨化單核細(xì)胞，從而為聲動力療法治療動脈粥樣硬化的機(jī)制進(jìn)行了有益的探索，對聲動力治療動脈粥樣硬化的臨床應(yīng)用起到了推動作用。結(jié)論1. 聲動力治療巨噬細(xì)胞通過促進(jìn)ATP釋放趨化單核細(xì)胞聚集。2. 聲動力治療巨噬細(xì)胞后ATP釋放增加依賴于caspase途徑的凋亡。致謝在七年制基礎(chǔ)科研訓(xùn)練即將完成之際，首先向我們的指導(dǎo)教師田野教授表示最衷心的謝意！本論文是在田老師的細(xì)心指導(dǎo)下完成的，在課題設(shè)計，實驗進(jìn)行和結(jié)果分析的整個過程中處處都凝聚著老師的心血。他獨(dú)特的思維方式，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，執(zhí)著的事業(yè)追求和崇高的敬業(yè)精神以及對學(xué)生的嚴(yán)格要

40、求和細(xì)心關(guān)懷令我們受益終生，他的人格魅力也令我們難忘，所有的這些也將成為我們今后做人做事的準(zhǔn)則。特別感謝孫鑫師兄、郭淑媛師姐、陳海波師兄在課題設(shè)計和實驗過程中給予的悉心指導(dǎo)和無私幫助，在實驗方面的大力支持，在實驗中給予的意見和建議，使我們受到很大的啟發(fā)，為實驗的順利進(jìn)行打下了良好的基礎(chǔ)。感謝本教研室的劉暢、旦菊花、姚劍挺、田芳等師兄師姐在實驗上對我的支持。感謝同組七年制的鄭子玲、黃宇航、馬偉康同學(xué)，在一起為了實驗而奮斗的日子里，我們一起收獲了成功的喜悅、拼搏的艱辛，這段難忘的時光，我們結(jié)下了深厚的友誼，這些都是我們終生的財富。感謝哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室為我們提供了一個良好的科研環(huán)境，這里

41、，不僅培養(yǎng)了我們的科研能力、創(chuàng)新思維，也增強(qiáng)了我們的獨(dú)立性和自信心，同時，也讓我們學(xué)到了書本上學(xué)不到的知識，這是一筆難得的人生財富，將陪伴我們在以后的事業(yè)中，勇往直前。衷心地祝愿病理生理教研室的全體老師和同學(xué)工作順利，身體健康！祝愿病理生理教研室永遠(yuǎn)輝煌！最后，感謝哈爾濱醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)七年制的所有同學(xué)在日常學(xué)習(xí)生活中對我們的幫助和支持！參考文獻(xiàn)1.LI JJ，F(xiàn)ANG C HAtheroscleritis is a more rational term for the pathological entity currently known as atherosclerosisJMed Hyp

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