分子試驗設(shè)計

1、分子實驗設(shè)計綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達張評瑜 2021141241157 田曉震 2021141241097綠色熒光蛋白(gree n fluoresce nt protein，GFP) 是一類存在于 包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當受到紫外或藍光激發(fā)時，GFP發(fā)射綠色熒光。EGFP (Enhanced GFP即增強 型綠色熒光蛋白，它的27k Da的單體由238個氨基酸構(gòu)成，本身就 是一個生物發(fā)光系統(tǒng)，附帶有激發(fā)后能發(fā)射生物熒光的發(fā)光色基。其 發(fā)光過程不同于其它生物發(fā)光組織， 是不需熒光素酶參與的。在紫外 光激發(fā)下可發(fā)綠色熒光，常用作信號蛋白或報告基因。將目的基因

2、與 EGFP基因插入載體重組表達后，可形成融合蛋白。通過熒光顯微鏡、 共聚焦顯微鏡或紫外燈觀察，可直接在活細胞中檢測其熒光信號，簡 易方便地定性檢測目的基因的表達，以及進一步研究目的蛋白的定位 與動態(tài)過程。實驗步驟：目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)化一目的基因篩選與鑒定1、質(zhì)粒DNA的提取及瓊脂糖電泳檢測1.1質(zhì)粒DNA的提取方法：堿裂解法原理：pEGFP-N3質(zhì)粒是一個用于在哺乳動物細胞系中表達EGFP融合蛋白的質(zhì)粒，它編碼了 EGFP蛋白，是野生型綠色熒光蛋白wtGFP經(jīng)技術(shù)改造而成的遺傳突變體；pet原核表達質(zhì)粒是 最有效的原核表達系統(tǒng)之一。目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體T

3、7強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制；表達由宿主細胞提供的T7RNA 聚合酶誘導(dǎo)。宿主菌帶有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可 以通過IPTG來啟動表達。充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細胞資源都用于 表達目的蛋白；誘導(dǎo)表達后僅幾小時，目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎?蛋白的50%以上。別離質(zhì)粒DNA的方法一般包括三個根本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì) 粒擴增、收集和裂解細菌、別離和純化質(zhì)粒DNA。50mmol/L葡萄糖、 10mmol/ EDTA-Na、25mmol/L Tris-HCl pH8.0分散細胞，其中螯合 金屬離子使酶失活，防止 DNA的降解；0.4mol/L NaOH和2% SDS 臨用前1:1配制，使細胞裂

4、解，蛋白質(zhì)與染色體 DNA發(fā)生變性； 60ml 5mol/L 醋酸鉀、11.5ml冰醋酸、28.5ml雙蒸水 使DNA在酸性條件下復(fù)性，留 在上清液，大腸桿菌DNA和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等發(fā)生沉淀。實驗用品：儀器：恒溫搖床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，10、 100、1000 Z微量移液器各一支，臺式高速離心機，制冰機，混合漩 渦器。1.1.4.2 材料： 含質(zhì)粒 pET-28a 和 pEGFP-N3 菌液、.5ml 塑 料離心管、EP管架、微量取液器和取液器吸頭、常用玻璃器皿如 三角瓶、量筒、試劑瓶等1.143試劑：LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨(Tryptone ) 10g,酵母 提取物(Yeast e

5、xtract ) 5 g , NaCI 5g,瓊脂(固體培養(yǎng)基)15g, 用 1N NaOH調(diào) pH 7.5。溶液 I: 50mmol/L 葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na 25mmol/L Tris-HCI (pH8.0);溶液 II: 0.4moI/L NaOH , 2% SDS，臨用前 1: 1 配制; 溶液皿：5moI/L醋酸鉀60ml，冰醋酸11.5ml，雙蒸水28.5ml ;卡納霉素(50mg/mL);抽提液(飽和酚：氯仿：異戊醇=25: 24: 1 );無水乙醇；70%L醇；TE緩沖液或ddH2O步驟：將含pET- 28a質(zhì)粒的大腸桿菌，含pEGFP-N；質(zhì)粒的大腸桿菌 分

6、別接種在液體培養(yǎng)基中(加卡那霉素 50卩g/mL), 37C培養(yǎng)過夜。1.1.5.2 取培養(yǎng)菌液1.5mL置Eppendof小管中，10000rpm離心 2min,棄上清液。1.1.5.3 參加100卩L溶液I，漩渦器上充分混勻，在室溫下放置 10 mi n。參加200卩L新配制的溶液I,輕輕翻轉(zhuǎn) 23次，使之混勻， 冰上放置5 min。參加150卩L冰冷的溶液皿，蓋緊后，溫和顛倒 3-5次使混 勻，產(chǎn)生白色絮狀物，冰上放置 15 min 。1.1.5.610000rpm 離心5 min，取上清液于另一干凈的離心管中向上清液中參加等體積約400卩L酚：氯仿/異戊醇25:24:1 , v/v ,

7、振蕩混勻，lOOOOrpm離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新 的離心管中。參加等體積約370卩L氯仿/異戊醇24:1 ,混勻，離心 2min ,取上清液于新離心管中。1.1.5.9 向上清液參加2倍體積無水乙醇，混勻，-20 C放置1h。1.1.5.10 12000rpm離心5 min,倒去上清液，把離心管倒扣在吸水 紙上，吸干液體。力口 800卩L70臨醇，12000rpm離心1 min，倒盡上清液， 室溫自然枯燥30min。1.1.5.12 力口 30 卩 L ddH20 , -20 C保存?zhèn)溆谩？记绊氈猴柡头尤∠聦訂为毼?00 uL氯仿：異戊醇24: 1 吸 200 uL制備質(zhì)粒過程中

8、，所有操作必須緩和，不要劇烈振蕩特 別是參加溶液II和III ,以防止機械剪切力對DNA的斷裂作用。在取各種試劑的過程中，一定注意移液器吸頭的更換， 防止污染。1.2瓊脂糖電泳檢測方法：瓊脂糖電泳原理：DNA的瓊脂糖凝膠電泳可以別離長度為 200bp至近 50kb的DNA分子。DNA的遷移率U的對數(shù)與凝膠濃度T之間存在反平行線性關(guān)系。因此，要有效地別離不同大小的DNA片段, 選用適當?shù)沫傊悄z濃度是非常重要的。在質(zhì)粒提取的過程中，由于操作原因，提取的質(zhì)粒可能有三種：線性DNA、開環(huán)DNA、閉環(huán)超螺旋DNA。當提取的質(zhì)粒DNA電泳時,同一質(zhì)粒DNA泳動速 度：閉環(huán)超螺旋線狀開環(huán)。但有時也有也會

9、出現(xiàn)相反情況，因為 與瓊脂糖濃度、電流強度、離子強度及核酸染料含量有關(guān)。123實驗用品：123.1 材料和儀器電泳儀，電泳槽，樣品槽模板梳子，有機玻璃內(nèi)槽，微波爐，水 平儀，10、100、1000卩L微量取液器各一支，凝膠成像系統(tǒng)，提取 的pET- 28a和pEGFP-N3質(zhì)粒，瓊脂糖，錐形瓶，一次性手套，膠鏟, 封口膜，剪刀，取液器吸頭。試齊IGold view DNA染料；0.5 x TBE緩沖液：Tris 10.88g、硼酸 5.52g、 EDTA Na2- 2H2O 0.74g,定容至200ml，使用時稀釋10倍；6x上 樣緩沖液：溴酚藍0.25 %、蔗糖40% DNA marker。

10、步驟：瓊脂糖凝膠板的制備稱取0.3g瓊脂糖，置于錐形瓶中，參加30mL0.5X TBE緩沖液，微波 爐加熱直至瓊脂糖溶解。待膠液冷卻到65C不燙手為宜，參加1卩L Gold view 混勻，排 除氣泡,緩慢倒入事先準備的制膠有機玻璃槽插入樣品槽模板梳 子內(nèi)。靜置30min左右，輕輕晃動拔出梳子。1.242力葉羊膠板放入電泳槽中樣品孔位于負極，注入0.5 x TBE緩沖液淹沒過 膠板5mm用取液器將提取的質(zhì)粒 DNAW L與1卩L6X上樣緩沖液混 勻，參加膠板的樣品小槽內(nèi)。1.2.4.3 電泳將電泳槽與電泳儀接通，調(diào)節(jié)電壓為 100 V左右，直至緩沖液的藍色指示劑移動到距離膠板邊沿約12cm處，

11、停止電泳。1.244觀察和拍照將膠板小心取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)位置居中，波長為254nm的紫外燈下，觀察凝膠中 DNA存在處顯示出熒光條帶。實驗結(jié)果預(yù)測：正常情況下會出現(xiàn)兩條條帶閉環(huán)和開環(huán) 質(zhì)粒。二、基因表達載體的構(gòu)建1、DNA限制性內(nèi)切酶酶切1.1方法：DNA限制性酶切1.2原理：生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈 DNA序列的一種內(nèi)切 核酸酶。由于這種切割作用是在 DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性SfTUOfl iRTlFlNnji9»jNv啊為I StfT.kjI 102Kho HlMi NDthlMIE-«g l(»Mf Hind mim taKim

12、klMiEnR耳即 BamH R1MiNM h»l i Nd* It時扣 Ndq IitMlXtH L：詭lSSgrA I皿Sph Mi酶切位點:BamHINotlEcaST I|ITF3；- pET«28a(+；53&9bplLAp*l|IXMffiMH 屮卻BtsSlihfj：:BspLUU 咐廠、k-91»i Bdiinri TumaP耳沾 IljZZXJIApaL IAse IIB)S/iaB1341)£co01091(3B52)CMVMCS1531-465)4SVTK poly APEGFP-N34.7 kbBsrG I 113$SV&

13、#171;poly A=Not I 11390Xba I* )1408)內(nèi)切酶簡稱限制酶。pet原核表達質(zhì)粒是最有效的原核表達系統(tǒng)之 一。目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體 T7強轉(zhuǎn)錄及翻 譯信號控制；表達由宿主細胞提供的 T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。宿主菌帶 有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通過IPTG來啟動表達。 充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白； 誘導(dǎo)表達后 僅幾小時，目的蛋白通常可以占到細胞總蛋白的 50%以上。Stu II(2S75iAffll 116361Dra III 11S70)MSOItilHI削側(cè)叭帥曲 測icWG加腳CTCAih師腳血CT

14、K6 山 ItMGT淞 ffilMcSMCCCGIiklMTCG 池:崗 刪腳III蹣I(yè)I *1 :-Ml fill釧 伽l艦廠巾涮I市I無Ltai師1計剛"I X/ua帥奸kll血I1.3實驗用品：材料：實驗一提取的質(zhì)粒 pEGFP-N3和pET-28a , 0.2mlEP管,取液器吸頭，一次性手套試劑：Not I, Bam HI, ddHzO, 10>buffer，瓊脂糖,Gold view設(shè)備：移液器，臺式高速離心機，凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，恒溫培養(yǎng)箱1.4步驟：分別去兩支0.2mlEP管做上記號：如兩個EP管中分別配置以下的30卩體系：號管號管BSA3 a l3 a

15、 l10xBuffer3 a l3 a lNot I2 a l2 a lBam HI2 a l2 a l質(zhì)粒pET -28a 20 a lpEGFP-T1 20 a l將兩只EP管混勻后瞬時離心，放入恒溫培養(yǎng)箱 37°C酶切3h取5卩L EP管的酶切反響液，同時取5原質(zhì)粒溶液作對照，進行電泳檢測酶切結(jié)果。按照回收試劑盒步驟切膠回收所需酶切產(chǎn)物片段 2、連接重組2.1方法：DNA連接重組2.2原理:連接的DNA分子具備的條件：具有相同粘性末端同種酶切 的片段的DNA分子比擬容易連接在一起，因為相同的粘性末端容 易通過堿基配對氫鍵形成一個相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。連接反響溫度：理論上講，連接反響的

16、最正確溫度是37°C，此時連接酶的活性最高。但37°C粘性末端分子形成的配對結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定， 因此，人們找到了一個最適溫度，即1216°C。此時既可最大限度地 發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。本實驗選擇16°C。2.3實驗用品：材料：酶切后的EGFP和pET-28a，0.2mlEP管，取液器吸頭,一次性手套2.3.2 試劑：T4DNA 連接酶，ddHzO, T4DNA 連接酶 buffer設(shè)備：移液器，臺式高速離心機，PCR儀2.4步驟： 在EP管中分別配置以下的體系:0.2mlEP 管10xbuffer2卩l(xiāng)酶切后的pET -28aXa l

17、沒切后的EGFP片段丫卩l(xiāng)T4DNA連接酶2 a lX : Y二1 : 310,用水補足20卩。24 EP管中液體混勻后瞬時離心，放入培養(yǎng)箱16°C反響過夜后，-200C下保存用于轉(zhuǎn)化。3. 重組DNA的轉(zhuǎn)化及重組子的鑒定3.1重組DNA分子的轉(zhuǎn)化方法：熱轉(zhuǎn)化法原理：細菌處于容易吸收外源 DNA的生理狀態(tài)叫感受態(tài)。 轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入細菌的 過程。其原理是細菌處于00C，在有CaCl2存在的低滲溶液中，菌細 胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸 復(fù)合物粘附于細胞外表，經(jīng)42°C短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA

18、 復(fù)合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過 程中獲得的新的表型在本實驗中為卡那霉素抗性得到表達。在含 Kana的選擇性培養(yǎng)基上進行重組子的鑒定E.coli EH5 a是一種常用于質(zhì)?？寺〉木?，可以使質(zhì)粒高拷貝數(shù)擴增，獲得大量的質(zhì)粒實驗用品341 材料：重組質(zhì)粒 pET-28a-EGFP, E.coli DH a 5用品：搖床，玻璃涂布器步驟取出感受態(tài)細胞DH5a讓其在冰上自然解凍，每200 L 解凍的感受態(tài)細胞參加整管連接產(chǎn)物，混勻后冰浴30mi n3.1.5.2 420C熱沖擊60秒，立即置于冰浴5min。再在感受態(tài)細胞混合物中參加 0.8mL的LB培養(yǎng)基，于 37&

19、#176;C搖床中培養(yǎng)1h。3.1.5.4 1h 后，6000r/min 離心 3min，去掉上清約留 200 L 的培養(yǎng)液，搖勻菌塊。用玻璃涂布器將溶液均勻涂布在含 Kana的LB固體培 養(yǎng)基上，正置培養(yǎng)皿半小時后，370C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)皿過夜。第二天早上觀察結(jié)果。結(jié)果預(yù)測由于轉(zhuǎn)入的pET-28a質(zhì)粒含有卡那霉素的抗性基因，所以能夠在含有Kana的培養(yǎng)基上面生長培養(yǎng)基上長出正常的菌落，表示質(zhì)粒轉(zhuǎn)入成功培養(yǎng)基上形成小菌落，轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒只一直沿著單個細胞 遺傳下去3.2重組子的鑒定由于質(zhì)粒pET-28a和質(zhì)粒pEGFP-N3相同的酶切位點為BamH I和NotI，兩個酶切位點之間并無標記基因，所

20、以即使在選擇培養(yǎng)基上表達為陽性，也可能說明轉(zhuǎn)入的為pET-28a質(zhì)粒，并不能完全確定 為重組質(zhì)粒，所以需進行重組子的檢測原理：利用PCR和雙酶切的方法對重組子進行鑒定PCR是在生物體外進行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反響，主要有變性一退火一延伸三個步驟組成：高溫變性-94 C下DNA雙鏈解旋為單鏈；低溫退火-55 C左右時，引物與模板DNA單鏈的互補序列配 對結(jié)合溫延伸-72 C時，Taq酶以4種dNTP為原料，引物為復(fù)制起點，按5'宀方向，復(fù)制模板的互補鏈。按此循環(huán)變性一復(fù)性一延伸，一般重2530次，短時間 內(nèi)，使目的基因片段擴增2n n代表循環(huán)次數(shù)。實驗材料3.2.1.2 材料DN

21、A模板，4XdNTP,T7正反引物，Taq酶，瓊脂糖，MarkerDNA，吸頭試齊I10 buffer, 15 mmol/L MgCI2PCR熱循環(huán)儀， 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)322雙酶切原理：由于質(zhì)粒的黏性末端是Not I, Bam HI,兩種限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的，載體和目的基因的粘性末端互補配對形成重 組質(zhì)粒，所以在重組質(zhì)粒上也存在Not I, Bam HI的酶切位點，在陽性克隆的細菌中提取質(zhì)粒，雙酶切過后對酶切后的產(chǎn)物檢驗，可以驗證是重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化成功。實驗材料3.2.2.1.1 試劑 Not I, Bam HI, lOWuffer,設(shè)備移液器，臺式高速離心機，凝膠電泳系統(tǒng)， 凝膠成像系統(tǒng)322.2步驟3.2.2.2.1 取一只 0.2ml 的 EP 管管中配置以下的體系EP管BSA10 x bufferNot I3卩L2卩L2卩LBam HI重組質(zhì)粒20卩L32223將EP管混勻后瞬時離心，放入恒溫培養(yǎng)箱 37°C酶切3h。32224取5卩LEP管的酶切反響液，同時取5L目的基因溶液 作對照，進行電泳檢測酶切結(jié)果。32223結(jié)果預(yù)測32223.1酶切產(chǎn)物中只出現(xiàn)一條帶，證明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入成功 32223.2酶切產(chǎn)物沒有出現(xiàn)條帶，證明轉(zhuǎn)化失敗3.3減小誤差方案由于是直接從平板中挑去菌落，轉(zhuǎn)化后的細菌 細胞壁外會附