結(jié)核分枝桿菌H37Rv的β-內(nèi)酰胺酶假說(shuō)的分子克隆,超表達(dá)和生物化學(xué)的特征

1、結(jié)核分枝桿菌H37Rv的-內(nèi)酰胺酶假說(shuō)的分子克隆，超表達(dá)和生物 化學(xué)的特征K.M. Nampoothiri, R. Rubex*, A.K. Patel*, S.S. Narayanan, S. Krishna, S.M. Das and A. Pandey印度,生物技術(shù)部，國(guó)家學(xué)科科學(xué)與技術(shù)學(xué)會(huì)（以前的區(qū)域研究實(shí)驗(yàn)室），CSIR雜志名稱：Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072影響因子：2.09 摘要目的：分子克隆，和來(lái)自于結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組的基因的超表達(dá)與生物學(xué)特征與-內(nèi)酰胺酶的活性有關(guān)。方法和結(jié)果：對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因

2、組的分析表明，Rv2068c，Rv0406c和Rv3677c基因產(chǎn)物進(jìn)行了預(yù)測(cè)，表現(xiàn)出-內(nèi)酰胺酶的活性。這三個(gè)基因都用pET28a載體克隆然后在C41(DE3)大腸埃希菌細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)。加標(biāo)記的重組蛋白被免疫印記法證實(shí)重組成功，同時(shí)通過(guò)對(duì)頭孢硝噻和其他的-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的水解反應(yīng)證實(shí)這些重組蛋白質(zhì)具有-內(nèi)酰胺酶活性。所有重組蛋白的催化參數(shù)均由酶的抑制試驗(yàn)所得出。用于重組菌株的抗生素敏感性試驗(yàn)顯示其對(duì)不同種類(lèi)的-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抵抗性的增加。結(jié)論：研究表明在結(jié)核分枝桿菌中可能有不止一個(gè)基因編碼具有-內(nèi)酰胺酶活性或類(lèi)似-內(nèi)酰胺酶活性的基因，因此使得結(jié)核分枝桿菌可以廣泛抵抗-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。這篇研

3、究的重要性和影響性：系統(tǒng)化的關(guān)于結(jié)核分枝桿菌-內(nèi)酰胺酶的假設(shè)研究，和相關(guān)的種類(lèi)及-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的抑制試驗(yàn)可以對(duì)于發(fā)展新的針對(duì)肺結(jié)核引起的多重耐藥的藥物抵抗菌株治療的新的抗生素很有幫助。關(guān)鍵詞：-內(nèi)酰胺酶，-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，結(jié)核分枝桿菌，頭孢硝噻前言：分枝桿菌菌株對(duì)于抗分枝桿菌藥物的抵抗性的增加和結(jié)核病在現(xiàn)在的死灰復(fù)燃都強(qiáng)調(diào)了尋找新的治療結(jié)核病手段是非常迫切的。-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素可以抑制細(xì)菌中的轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)和阻止細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，所以是非常廣泛的抗微生物制劑。然而大多數(shù)分支桿菌是天然抵抗-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，大概是因?yàn)樗鼈兊姆浅Ｊ杷募?xì)胞壁，雖然其細(xì)胞質(zhì)中存在青霉素結(jié)合蛋白但重要的是它同時(shí)存在-內(nèi)酰胺

4、酶催化水解-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的作用。大多數(shù)的結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，在酶的結(jié)構(gòu)上，分類(lèi)上有不同，以及是否分泌細(xì)胞質(zhì)或者綁定細(xì)胞膜和關(guān)于是否其產(chǎn)物是可誘導(dǎo)或是構(gòu)成的。對(duì)分枝桿菌-內(nèi)酰胺酶的動(dòng)力學(xué)研究大多與酶制劑不純有關(guān)，或者與已推斷間接的關(guān)于-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和-內(nèi)酰胺酶抑制劑的合成物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果有關(guān)。系統(tǒng)的研究結(jié)核分枝桿菌-內(nèi)酰胺酶和與其相關(guān)的種類(lèi)，還有對(duì)于相應(yīng)的-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素及其抑制劑的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的研究，有利于對(duì)新的抗生素制劑的發(fā)展。來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的DNA文庫(kù)的粘粒上的開(kāi)放閱讀框架和已知的A類(lèi)-內(nèi)酰胺酶具有同源性，該基因從結(jié)核分枝桿菌的染色體上的DNA用PCR擴(kuò)增出來(lái)，而

5、且被Vloadri用大腸埃希菌中高表達(dá)。重組酶的動(dòng)力學(xué)與直接用pI是5.1和4.9從結(jié)核分枝桿菌中提取出來(lái)的-內(nèi)酰胺酶相似，該重組酶主要表現(xiàn)出青霉素酶的活性。事實(shí)上，作者也提出了第二個(gè)可能性，即一小部分的-內(nèi)酰胺酶也具有相對(duì)較強(qiáng)的的頭孢菌素酶活性。有相關(guān)報(bào)道說(shuō)無(wú)毒的結(jié)核分枝桿菌H37Ra的主要的-內(nèi)酰胺酶Bla A基因與Rv2068c中的BlaC基因的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同。在恥垢分枝桿菌中的主要的-內(nèi)酰胺酶基因（Bla S/Bla A,Bla E)與偶發(fā)分枝桿菌中的A級(jí)分枝桿菌中的Bla F基因生物化學(xué)特征相似。這個(gè)結(jié)構(gòu)說(shuō)明Bla C具有成為用-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物和-內(nèi)酰胺酶抑制劑的混合劑治療結(jié)核的

6、潛在的作用靶點(diǎn)。對(duì)于分支桿菌中-內(nèi)酰胺酶的詳細(xì)分布和精確的特征是迫切需要闡述的，以便用于評(píng)估未來(lái)在治療肺結(jié)核中-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的作用角色。很少有臨床證據(jù)表明，-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素與-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合，如阿莫西林-克拉維酸，氨芐西林-舒巴坦，該組合在結(jié)核分枝桿菌感染的治療過(guò)程起作用。結(jié)核分枝桿菌基因組序列測(cè)定的完成，已經(jīng)打開(kāi)了通向治療結(jié)核病的新的途徑。這篇研究說(shuō)明了存在有不止兩種的蛋白質(zhì)，除了BlaC，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株中有類(lèi)似于-內(nèi)酰胺酶活性的蛋白質(zhì)存在，提供了抵抗-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的抗普性。材料和方法：菌株，化學(xué)藥品和試劑pET28a載體從USA，Novagen獲得，然后在從USA，Av

7、idis獲得大腸桿菌C41(DE3)的表達(dá)體系中表達(dá)?？寺〉牟襟E在大腸桿菌Top 10細(xì)胞中進(jìn)行，該細(xì)胞來(lái)源于UK在泰恩河上的紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株中的染色體DNA來(lái)自USA，科羅拉多州大學(xué)，而且是在研究材料轉(zhuǎn)移的協(xié)議書(shū)的基礎(chǔ)下進(jìn)行的。PCR克隆試劑盒，小量制備試劑盒QIAprep，QIAquick凝膠提取試劑盒和他的抗體試劑盒均購(gòu)自Qiagen公司，德國(guó)。限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶和DNA聚合酶是從新英格蘭BioLabs公司和美國(guó)MBI Fermentas公司獲得。相關(guān)蛋白純化柱獲得于GE醫(yī)療保?。ˋmersham公司）?？故驣gG抗體，對(duì)位硝基氯化四氮唑/ 5溴- 4

8、 -氯-3吲哚磷酸（NBT / BCIP）用于免疫檢測(cè)，均來(lái)自于美國(guó)Sigma公司。寡居核苷酸引物來(lái)自于印度的Bangalore Genie公司。頭孢硝噻基片來(lái)自于UK牛津大學(xué)。-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和普通的分子生物學(xué)級(jí)別的化學(xué)用品在本研究中使用，均購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司，默克公司，和印度Hi公司。質(zhì)粒和DNA制備所有的DNA制備均遵照標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，就像Sambrook等人描述的一樣。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的Rv2068c（blaC），Rv0406c（-內(nèi)酰胺酶樣蛋白）和Rv3677c（可能是水解酶）的克隆所有這三個(gè)基因，都是用結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中的DNA進(jìn)行的PCR擴(kuò)增得來(lái)的。用來(lái)擴(kuò)增

9、Rv2068c，Rv0406c，Rv3677c的引物分別是，F(xiàn)PblaC5'GAT CGA TCC ATA TGC GCA ACA GAG GAT TCG3'（包括一個(gè)Nde 1限制位點(diǎn)，重點(diǎn)標(biāo)注）和RP blaC5'GAT CGA TCG CGG CCG CCT ATG CAA GCA CAG CGG CAA3'（包括一個(gè)Not 1限制位點(diǎn)，重點(diǎn)標(biāo)注），F(xiàn)P blp5'CAT AAA AAT GAA TTC CAT ATG GTC GCG ACC CGC GGC（包括一個(gè)Nde 1限制位點(diǎn)，重點(diǎn)標(biāo)注）和RP blp 5'GCC CCC CCC

10、GAA TTC TAA CTA CCG AAA TAC ATG ATT 3'（包括一個(gè)EcoRI限制位點(diǎn)，重點(diǎn)標(biāo)注），F(xiàn)P ph5' TTC CCG GCC GAA TTC CAT ATG TCG AAG ACA GCT GAG 3'（包括Nde 1限制位點(diǎn)，重點(diǎn)標(biāo)注）和RP ph 5' CCG CTC GAG GAA TTC TAA CTA CCG AGT CCG CAG ATA 3'（包括一個(gè)EcoRI限制位點(diǎn)，重點(diǎn)標(biāo)注）。為了證實(shí)PCR產(chǎn)物，被擴(kuò)增的產(chǎn)物（blaC 924 bp,-內(nèi)酰胺酶樣蛋白819bp和類(lèi)似水解酶795bp）在Genei Pvt

11、 Ltd,Bangalore被測(cè)序。PCR產(chǎn)物被純化，被各自的消化酶消化，然后再用各自的酶導(dǎo)入表達(dá)載體pET 28a中形成重組質(zhì)粒pET28a:blaC，pET28a:Rv0406c和pET28a:Rv3677c.合成質(zhì)粒在通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌C41（DE3）中。超表達(dá)，復(fù)興和純化過(guò)夜培養(yǎng)的大腸埃希菌C41(DE3)攜帶有質(zhì)粒pET28a:blaC，pET28a:Rv 0406和pET28a:Rv3677c接種于200ml的LB肉湯培養(yǎng)基，其中加有30g ml-1卡那霉素，然后在37 200轉(zhuǎn)每分的搖床中培養(yǎng)，直到光密度（OD600)達(dá)到O.6-0.7.該基因的表達(dá)由1mmol-1異丙基

12、-D 半乳糖硫吡喃糖苷類(lèi)（IPTG）3.5小時(shí)在37誘導(dǎo)。細(xì)胞在離心速度在5009g在4中分離出。將沉淀的細(xì)胞再懸浮于10ml的裂解緩沖液，其中包括20mmol-1磷酸鹽緩沖液（PH 7.4），500mmol-1NaCl，5mmol-1咪唑，蛋白酶抑制劑所組成的混合試劑（德國(guó)，Roche）和6mmol-1-巰基乙醇。細(xì)胞用56%振幅的超聲處理（Sonics，USA）進(jìn)行破壞，進(jìn)行10s開(kāi)10s關(guān)的一共持續(xù)7分鐘的冰下脈沖。該裂解物在4，11270g的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，從而分離出可溶蛋白。清澈的上清液和沉淀分別用12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)表達(dá)情況，這表明大多數(shù)結(jié)合蛋白是在相應(yīng)的細(xì)胞

13、顆粒中的細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)的。沉淀物在用1%的Triton X-100洗滌兩次然后再懸浮于提取緩沖液中，其中含有3mol-1尿素，500mmol l-1NaCl，20mmol l-1的磷酸鹽緩沖液中（PH 7.4）和6mmol l-1-巰基乙醇，然后放入冰下1小時(shí)，再在4的條件下離心15分鐘，離心速度是11270g。蛋白質(zhì)的復(fù)性用Ni-NTA柱。尿素中的蛋白質(zhì)樣本裝上1ml Ni-affinity His-trap柱。裝上之后，該柱用五個(gè)柱的容積的緩沖液洗滌，其中含有20mmol l-1的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），500mmol l-1NaCl,6mmol l-1-巰基乙醇和5mmol l-1咪

14、唑。重組蛋白質(zhì)被含有500mmol l-1的NaCl和20mmol l-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）還有梯度的咪唑（50-500mmol l-1）洗滌然后用1ml碎片被收集。另外，重新折疊的蛋白質(zhì)，含有尿素組份的重組蛋白質(zhì)被復(fù)性緩沖液（20mmol-1磷酸鹽緩沖液 pH7.4，500mmol-1 NaCl和1mol l-1精氨酸）稀釋到0.1mg ml-1的濃縮蛋白，混合均勻然后保存在4環(huán)境中1個(gè)小時(shí)。精氨酸逐步用20mmol l-1的磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)琾H7.4，精氨酸的濃度從1到0 mol l-1在4。復(fù)性蛋白進(jìn)一步稀釋使用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），其中包含1mg ml-1BSA，然

15、后一直保持到70，直到使用。這兩種方法都用于三種蛋白質(zhì)。測(cè)定蛋白濃度和-內(nèi)酰胺酶的活性對(duì)于不同種樣本中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定是用Bradford's方法（Bradford 1976）用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。頭孢硝噻吩的顯色反應(yīng)（Oxoid）被用來(lái)測(cè)定-內(nèi)酰胺酶的活性。該方法測(cè)定進(jìn)行于30 100mmol l-1頭孢硝噻的20mmol l-1的磷酸鹽緩沖液中，pH 7.4。檢測(cè)486nm水解使用UV分光光度計(jì)（Shimadzu,Japan）和記錄10分鐘內(nèi)不超過(guò)30s的吸光度。Nitrocefine每個(gè)蛋白質(zhì)水解率用每微克頭孢硝噻每分鐘水解每微克蛋白表示。SDS-PAGE電泳和蛋白印跡法酶制劑的

16、純度檢測(cè)每一步都需要運(yùn)行12%的SDS-PAGE電泳。純化蛋白被裝上12%的SDS-PAGE凝膠電泳，并電泳轉(zhuǎn)移到Immobilon-P的轉(zhuǎn)移膜上。在用3%的牛血清白蛋白封閉后該膜再用TBS吐溫/海衛(wèi)緩沖劑沖洗兩次。該印跡在anti-His主要抗體溶液中（1:1000稀釋度）放于常溫中1小時(shí)。該膜再用IgG與堿性磷酸酶結(jié)合的次級(jí)抗體（1:5000稀釋度）處理之前，用TBS和TBS吐溫/海衛(wèi)緩沖劑沖洗。免疫反應(yīng)用顏色測(cè)定，用NBT/BCIP作為底物。最后，該印跡用蒸餾水清洗和風(fēng)干。動(dòng)態(tài)測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)是觀察頭孢硝噻在486nm起始水解率（英國(guó)的牛津，劍橋），波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)最大改變吸收率在沒(méi)有水解底物和水

17、解的產(chǎn)物之間。所有的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)都是在30下20mmol l-1的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中進(jìn)行。蛋白提取液被含有1mg ml-1BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度為0.1mg ml-1，用來(lái)防止酶的變性和為水解實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。除非它有另外的指定，對(duì)于BlaC，5g l-1蛋白 用來(lái)測(cè)定另外兩種蛋白，10g l-1已經(jīng)用過(guò)。每個(gè)底物酶合成物的Vmax和Km都從1/V到1/s繪圖（利-伯氏標(biāo)繪圖），線性的Michaels-Menton方程，用電腦化軟件（Hyper32;生物化學(xué)部門(mén)，利物浦大學(xué)，英國(guó)和Graph Pad prism 5）抗菌敏感性最小抑菌濃度（MIC）是用無(wú)菌的96孔微量滴定板，其中

18、加入微小肉湯稀釋液。C41（DE3）大腸埃希菌細(xì)胞攜帶相應(yīng)的重組質(zhì)粒pET28a用于這三種基因的研究。重組的大腸埃希菌細(xì)胞在LB肉湯（OD600值是0.6）被IPTG誘導(dǎo)。像阿莫西林，阿莫西林-克拉維酸，氨芐西林，頭孢噻啶，頭孢噻肟和頭孢唑啉的抗生素濃度在0.25-128g ml-1作為最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)的濃度范圍。重組株的高度的-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抵抗也說(shuō)明用一個(gè)不同的方法在18小時(shí)培養(yǎng)重組株接種（0.5%v/v）在50ml LB培養(yǎng)基其中含有卡那霉素（30g ml-1）上，放入250ml錐形瓶當(dāng)OD600到達(dá)0.7時(shí)，加入1mmoll-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),在誘導(dǎo)后30分鐘，像阿莫西林（ 5 0g

19、 ml-1），頭孢噻啶（50g ml-1）和卞青霉素（75g ml-1）等抗生素分別的加入然后細(xì)胞生長(zhǎng)超過(guò)6個(gè)小時(shí)后加入其他抗生素，用OD值在600nm進(jìn)行檢測(cè)。6個(gè)小時(shí)后在等分LB平板上活菌數(shù)也要檢測(cè)。抑制試驗(yàn)酶和抑制劑在30的環(huán)境下放在一起5分鐘，然后它的水解率用100mmol l-1的頭孢硝噻作為底物測(cè)定。酶的失活與不同濃度的-內(nèi)酰胺酶抑制劑（0.25-100g ml-1)一起研究。Ki值用頭孢硝噻作為底物測(cè)定。酶被加入一個(gè)混合有抑制劑和頭孢硝噻，其吸光度的變化在486nm進(jìn)行測(cè)定。-內(nèi)酰胺酶抑制劑的濃度需要減少超過(guò)50%的頭孢硝噻的水解率，被定義為IC50。除了直接測(cè)定卞青霉素，卞青霉

20、素的Km值是由Ki決定的，Ki是用來(lái)假定競(jìng)爭(zhēng)性抑制是的值，其中底物是頭孢硝噻。結(jié)果表達(dá)和純化在IPTG誘導(dǎo)和細(xì)胞破碎后，認(rèn)為大多數(shù)的表達(dá)蛋白仍然保留在沉淀里，然后可以用含有3mol-1尿素的緩沖劑提取出來(lái)，然后在含有Ni2+NTA-His的柱中純化與圖中1b相似。大多數(shù)的重組蛋白被含有150mmol l-1的咪唑洗脫成碎片。三種蛋白在純化和復(fù)性后的產(chǎn)出率是在120-150mg l-1的范圍內(nèi)。按照氨基酸序列，計(jì)算BlaC的分子量，-內(nèi)酰胺酶樣類(lèi)蛋白和可能的水解酶的大小分別是32.56，29.22和28.48kDa?？紤]到加入His標(biāo)記，蛋白質(zhì)條帶中含有SDS-PAGE，分子量可能發(fā)生微小的變化

21、。重組蛋白用Western印跡抗體His標(biāo)記抗體進(jìn)行進(jìn)一步的證實(shí)。（重組蛋白的超表達(dá)，純化和確認(rèn)。a.12%SDS-PAGE顯示在3mol-1尿素提取物中的超表達(dá)蛋白。1縱是BlaC蛋白；2縱是-內(nèi)酰胺酶類(lèi)蛋白；3縱是可能的水解酶；4縱是分子量標(biāo)準(zhǔn)。b 12%SDS-PAGE顯示在通過(guò)His trap Ni2+親和層析柱后的蛋白質(zhì)純化情況。1縱是蛋白的比較標(biāo)準(zhǔn)；2縱是BlaC蛋白；3縱是-內(nèi)酰胺酶類(lèi)蛋白；4縱是可能的水解酶。c 用抗His抗體進(jìn)行的重組蛋白的免疫檢測(cè)的蛋白印跡結(jié)果。1縱是BlaC蛋白；2縱是-內(nèi)酰胺酶類(lèi)蛋白；3縱是可能是水解酶；4縱是預(yù)染的蛋白標(biāo)記。)動(dòng)力學(xué)研究BlaC的動(dòng)力學(xué)

22、參數(shù)，用頭孢硝噻和卞青霉素作為底物，被呈現(xiàn)在表1中。（Ki對(duì)于EDTA表示為mol-1，對(duì)于克拉維酸+阿莫西林表示gml-1）BlaC的Km和催化效率（Kcat/Km）用卞青霉素做底物，其值分別是500mol-1和0.174mol-1。Kcat/Km的值與曾經(jīng)的報(bào)道比較，當(dāng)時(shí)BlaC的Kcat/Km的值是0.293mol-1s-1,用氨芐西林做底物。BlaC在用頭孢硝噻，和顯色的頭孢菌素做底物時(shí)的Kcat/km值是0.418mol-1s-1，與底物是卞青霉素時(shí)的Kcat/Km的值比較高出2.4倍，說(shuō)明BlaC對(duì)于頭孢硝噻比卞青霉素有更多的特異性。內(nèi)酰胺酶類(lèi)似蛋白對(duì)于卞青霉素的親和性（Kcat/

23、Km=0.0266mol-1s-1)比對(duì)于頭孢硝噻的親和性（Kcat/Km=0,0163mol-1s-1）要稍高一些?？赡艿乃獾鞍椎腒cat/Km值，在用頭孢硝噻做底物時(shí)是0.0216mol-1s-1，比用青霉素做底物（0.00641mol-1s-1）高出3.3倍（如表2）。一般而言，BlaC蛋白對(duì)于卞青霉素和頭孢硝噻的親和力比內(nèi)酰胺酶類(lèi)似蛋白和類(lèi)似水解酶對(duì)其親和性的要高。內(nèi)酰胺酶類(lèi)似蛋白顯示出對(duì)青霉素和頭孢硝噻等同的親和性，而可能水解酶顯示出對(duì)頭孢硝噻更高的親和性，但是兩者的催化效率都很低。（表1和2）。結(jié)果說(shuō)明BlaC顯示出青霉素酶和頭孢菌素酶活性，其也是結(jié)核分枝桿菌中的內(nèi)酰胺酶的主要成

24、分，其他兩種酶只占極小的部分。抑制試驗(yàn)是用克拉維酸和阿莫西林的組合還有EDTA對(duì)三種蛋白質(zhì)完成的，而且顯示出克拉維酸和阿莫西林對(duì)于BlaC在Ki值是1.49gml-1（表1）時(shí)是比較有效的。作為商用的克拉維酸/阿莫西林混合物的摩爾比率沒(méi)有提到，Ki是用mol-1替代g ml-1。內(nèi)酰胺酶類(lèi)似蛋白和可能性的水解酶的水解活性完全被低濃度的克拉維酸/阿莫西林（<2.5g ml-1）組合物所抑制。數(shù)據(jù)表明克拉維酸對(duì)于BlaC蛋白具有很弱的抑制性，而對(duì)于另外兩種蛋白卻是完全的抑制。這個(gè)發(fā)現(xiàn)支持早些的報(bào)道，該抑制研究說(shuō)明克拉維酸對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的BlaC（Ki=2.4g ml-1）蛋白有相對(duì)弱的抑制

25、性，比TEM-1高出24倍。EDTA對(duì)于三種蛋白質(zhì)具有非常弱的抑制性，其對(duì)BlaC的Ki值計(jì)算為1280mol-1，對(duì)于內(nèi)酰胺酶類(lèi)似蛋白的值是2280mol-1，對(duì)于可能性的水解酶的值是2230mol-1（表1和2），因此表明這些酶都不是金屬酶。這些也與前面關(guān)于結(jié)核分枝桿菌的BlaC的報(bào)道一致，那里提到Y(jié)49酶不被EDTA所抑制即使其濃度達(dá)到100mmol l-1。（Ki在表達(dá)EDTA時(shí)用mol-1表達(dá)，在表達(dá)克拉維酸和阿莫西林時(shí)gml-1。ND表示沒(méi)在本實(shí)驗(yàn)中提過(guò)）易感性實(shí)驗(yàn)在不同方法例如紙片擴(kuò)散法試圖分析三種混合株易感性實(shí)驗(yàn)，滿意的結(jié)果是從微肉湯稀釋法獲得的。五種不同的內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的MI

26、C值就是用此方法測(cè)定的，結(jié)果在表3中表示。每個(gè)抗生素濃度測(cè)試像之前提到的，方法是藥物敏感性實(shí)驗(yàn)對(duì)于每種抗生素，用在檢測(cè)重組細(xì)胞中的生長(zhǎng)狀況。除了頭孢噻肟，其他的抗生素，重組株顯示出更好的抵抗，最大抵抗值能達(dá)到8gml-1對(duì)于頭孢噻啶。與其他兩個(gè)重組體相比，C41（DE3）大腸埃希菌細(xì)胞中的質(zhì)粒pET28a:blaC顯示出輕微的抵抗羧芐西林，羧芐西林屬于青霉素中carboxpenicllin的亞群。頭孢噻肟，第三代頭孢菌素，控制和重組體都沒(méi)顯示出任何生長(zhǎng)跡象，甚至濃度在2.5gml-1。在放入內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素?zé)吭囼?yàn)中，所有的三個(gè)重組體均表現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的生長(zhǎng)。對(duì)于C41（DE3）株顯示一個(gè)跡象，即

27、在裝有卞青霉素中生長(zhǎng)6個(gè)小時(shí)后減少，而且這個(gè)減少對(duì)于在起始階段有阿莫西林和頭孢噻啶的減少更明顯（圖2）。在卞青霉素作用6個(gè)小時(shí)后，有生命力的細(xì)胞數(shù)在控制株是5.5×108，重組株是1.4×109到1.9×109。在這三種情況中，內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抵抗由于內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素被重組酶水解。（各種-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的對(duì)于大腸埃希菌重組體表達(dá)結(jié)核分枝桿菌中的BlaC，-內(nèi)酰胺酶樣蛋白和可能性的水解酶的最小抑菌濃度MIC。C41（DE3）帶有pET28a載體作為標(biāo)準(zhǔn)株。1-標(biāo)準(zhǔn)株；2-BlaC重組株；3-內(nèi)酰胺酶類(lèi)似蛋白的重組株；4-可能的水解酶的重組株）討論幾種土壤中的細(xì)菌物種產(chǎn)生

28、-內(nèi)酰胺類(lèi)物質(zhì)，也許是作為抵抗其他細(xì)菌的武器（雖然這還存在爭(zhēng)議）。在進(jìn)化的時(shí)期，敏感細(xì)菌對(duì)-內(nèi)酰胺類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶作為抵抗。-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生也許是最為常見(jiàn)的呼吸道病原體?？偟膩?lái)說(shuō)，82%的粘膜炎莫拉菌隔離群產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，18.1%的Heamophilus流感和89%的金黃色葡萄球菌株產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶。結(jié)核分枝桿菌也是呼吸道病原體，也繼承有這種產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶的能力，從而更適于在這個(gè)環(huán)境下生存。分支桿菌普遍抵抗-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是主要因?yàn)?內(nèi)酰胺酶的存在。作為備用治療，-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和-內(nèi)酰胺酶抑制劑的混合制品成為有效的作用于體外結(jié)核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌等。克服-內(nèi)酰胺酶水解是對(duì)于-內(nèi)酰胺類(lèi)

29、抗生素起到效果的主要挑戰(zhàn)任務(wù)，因此對(duì)結(jié)核分枝桿菌中的-內(nèi)酰胺酶的認(rèn)識(shí)是至關(guān)重要的。在結(jié)核分枝桿菌H37Rv中的BlaC蛋白是由Rv2068c編碼，被認(rèn)為是與抵抗-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素防御機(jī)制中最起到最主要作用的-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)有許多地方與真菌的-內(nèi)酰胺酶相似。保守結(jié)構(gòu)域揭示BlaC與Pen P蛋白有相似性，來(lái)自于蛋白菌伯霍爾德桿菌的A類(lèi)-內(nèi)酰胺酶和來(lái)自棍狀桿菌屬的催化水解羧酯酶，它們的結(jié)構(gòu)與C級(jí)-內(nèi)酰胺酶蛋白和其他PBP相似。從序列，預(yù)測(cè)在N末端有原核脂質(zhì)接觸位點(diǎn)（Prosite PS51257）和-內(nèi)酰胺酶 A的活動(dòng)位點(diǎn)（Prosite PS00146）。一般說(shuō)來(lái)，C級(jí)-內(nèi)酰胺酶家族

30、，是絲氨酸-內(nèi)酰胺酶家族。-內(nèi)酰胺酶類(lèi)似蛋白是被結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv0406c編碼的蛋白，它的基因組序列有多于70%的相似度與草分枝桿菌比較，麻風(fēng)分支桿菌和鳥(niǎo)分支桿菌有少于50%的相似度與來(lái)自于麥芽黃單胞菌中的類(lèi)似于-內(nèi)酰胺酶 L1前體蛋白比較。在我們研究中的第三種基因，可能的水解酶是由基因Rv3677c編碼，有將近82%的序列與麻風(fēng)分分枝桿菌相似，55%與天藍(lán)色鏈球菌的類(lèi)似水解酶相似。將近有35%與來(lái)自于新月柄桿菌中的金屬-內(nèi)酰胺酶家族蛋白相似，還有一些其他的Proteobacterium相似。結(jié)果顯示-內(nèi)酰胺酶類(lèi)似蛋白和可能性的水解酶的保守區(qū)都與GloB的基因序列相似，它是Zn依賴

31、的水解酶來(lái)自蛋白酶鼠疫耶爾森菌，Clavibacter michiganensis的金屬-內(nèi)酰胺酶超家族，中間耶爾森菌的-內(nèi)酰胺酶家族中類(lèi)的金屬依賴的水解酶，大腸埃希菌中-內(nèi)酰胺酶家族中類(lèi)的金屬依賴的水解酶等。Expasy Prosite的掃描與-內(nèi)酰胺酶樣蛋白和可能性的水解酶的基因序列沒(méi)有顯示出有關(guān)-內(nèi)酰胺酶活性或脂質(zhì)附件的特征序列。對(duì)于可能性水解酶的分子量改變比起SDS-PAGE可能更歸功于不規(guī)則偏移在凝膠上，可以因?yàn)槟承┌被釟埢母叩某霈F(xiàn)率當(dāng)報(bào)道某些結(jié)核分枝桿菌和其他一些細(xì)菌蛋白，或者因?yàn)橐恍┑鞍浊鍧崉?fù)合物的罕見(jiàn)的形狀或者是低度的SDS綁定到蛋白上，就像報(bào)道的Actinomadura

32、 R39-內(nèi)酰胺酶一樣。關(guān)于水解的研究揭示了BlaC有青霉素酶和頭孢菌素酶的活性。最近，Wang等人報(bào)道了BlaC有很寬的范圍特異性，對(duì)于青霉素酶和頭孢菌素酶的活性是相等的。-內(nèi)酰胺酶的某些氨基酸取代，像Arg244，Asn276，Arg275，Met69，Met182和Tro165被報(bào)道過(guò)，它們?cè)黾訉?duì)于克拉維酸的抵抗性，這些置換揭示了結(jié)核分枝桿菌的BlaC的晶體結(jié)構(gòu)。也有一種假設(shè)，關(guān)于BlaC的廣泛的底物特異性是因?yàn)樗撵`活的底物結(jié)合位點(diǎn)，它可以適應(yīng)不同類(lèi)型的底物。也有早期報(bào)道，在缺失blaC基因的結(jié)核分枝桿菌中，其對(duì)-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的敏感性增加，從8到256，這也顯示了blaC在結(jié)核分枝桿菌中的主要作用。事實(shí)上，當(dāng)用-內(nèi)酰胺酶抑制劑和抗結(jié)合的乙胺丁醇結(jié)合物作用時(shí)，多重耐藥的結(jié)核分枝桿菌的-內(nèi)酰胺酶的MIC值比0.5mg ml-1小。（圖2 -內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抵抗在培養(yǎng)基上，用重組的大腸埃希菌表達(dá)結(jié)核分枝桿菌蛋白，表現(xiàn)出-內(nèi)酰胺酶的活性。A.阿莫西林抵抗50g ml-1。b.頭孢噻啶抵抗50g ml-1。c.卞青霉素75g ml-1。代表重組的大腸埃希菌表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌的H37Rv的可能性水解酶。代表