果蠅雜交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、 果蠅雜交實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分離規(guī)律、自由組合規(guī)律、伴性遺傳和連鎖互換規(guī)律，掌握果蠅雜交的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和基因定位的三點(diǎn)測驗(yàn)方法，在實(shí)驗(yàn)中熟練運(yùn)用生物統(tǒng)計(jì)的方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析?！緦?shí)驗(yàn)原理】1. 果蠅（fruit fly）是雙翅目（Diptera）昆蟲，屬果蠅屬（genus Drosophila），約有3000多種，我國已發(fā)現(xiàn)800多種。大部分的物種以腐爛的水果或植物體為食，少部分則只取用真菌，樹液或花粉為其食物。以果蠅作為遺傳學(xué)研究的材料，利用突變株研究基因和性狀之間的關(guān)系已近一百年，至今，各種研究遺傳學(xué)的工具已達(dá)完善的地步，果蠅對今日的遺傳學(xué)的發(fā)展有其不可磨滅的貢獻(xiàn)；從1980年初，

2、Drs. C. Nesslein-Volhard和E. Weichaus以果蠅作為發(fā)育生物學(xué)的模式動(dòng)物，利用其完備的遺傳研究工具來探討基因是如何調(diào)控動(dòng)物體胚胎的發(fā)育，也帶動(dòng)了其它模式生物（線蟲、斑馬魚、小鼠和擬南芥等）的研究，且有非常具體的成果。通常用作遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)材料的是黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）。用果蠅作為實(shí)驗(yàn)材料有許多優(yōu)點(diǎn)：飼養(yǎng)容易。在常溫下，以玉米粉等作飼料就可以生長，繁殖。生長迅速。十天左右就可完成一個(gè)世代，每個(gè)受精的雌蠅可產(chǎn)卵400500個(gè)，因此在短時(shí)間就可獲得大量的子代，便于遺傳學(xué)分析。染色體數(shù)少。只有4對。唾腺染色體制作容易。橫紋清晰，是細(xì)胞學(xué)觀察

3、的好材料。突變性狀多，而且多數(shù)是形態(tài)突變，便于觀察。果蠅的生活史：果蠅的生活周期長短與溫度有密切關(guān)系。一般來說，30以上溫度能使果蠅不育或死亡，低溫能使生活周期延長，生活力下降，飼養(yǎng)果蠅的最適溫度為2025。生活周期長短與飼養(yǎng)溫度的關(guān)系10152025卵幼蟲幼蟲成蟲57天18天8天6天5天4天果蠅在25時(shí)，從卵到成蠅需10天左右，成蟲可活2633天。果蠅的生活史如下：雌蠅 減數(shù)分裂 卵受精雄蠅 減數(shù)分裂 精子 第一批成蟲羽化（第八天）（可活2633天） 產(chǎn)第一批卵蛹（第四天）第二次蛻皮 第一批卵孵化（第二天） （第零天）第一次蛻皮 幼蟲（第一天）果蠅的生活周期和各發(fā)育階段的經(jīng)過時(shí)間果蠅的性別及

4、突變性狀的鑒別：果蠅的每一體細(xì)胞有8個(gè)染色體（2n=8），可配成4對，其中3對在雌雄果蠅中是一樣的，稱常染色體。另外一對稱性染色體，在雌果蠅中是某，在雄蠅中是XY。果蠅的雌雄在幼蟲期較難區(qū)別，但到了成蟲期區(qū)別相當(dāng)容易。雄性個(gè)體一般較雌性個(gè)體小，腹部環(huán)紋5條，腹尖色深，第一對腳的跗節(jié)前端表面有黑色鬃毛流，稱性梳（Sex bs）。雌性環(huán)紋7條，腹尖色淺，無性梳。實(shí)驗(yàn)中選用的果蠅突變性狀一般都可用肉眼鑒定，例如紅眼與白眼，正常翅與殘翅等。而另一些性狀可在解剖鏡下鑒定，如焦剛毛與直剛毛等?，F(xiàn)列表如下：實(shí)驗(yàn)中使用的果蠅突變品系影響部分突變名稱基因符號(hào)染色體上座位翅眼色體色剛毛翅形殘翅白眼黑體焦剛毛小翅v

5、gwbsnmIIR 67.0X 1.5IIR 48.5X 21.0X 36.1焦剛毛的基因座為sn3, 本文簡寫為sn。2.野生型果蠅為紅眼、灰身、長翅、直剛毛，與這些性狀對應(yīng)的突變性狀很多，其中灰身（+）與黑身（b）是一對相對性狀，且灰身對黑身為完全顯性，控制這對相對性狀的基因位于第二號(hào)染色體上。用具有這對相對性狀的兩純合親本雜交，性狀的遺傳行為應(yīng)符合分離定律。3. 黑體果蠅的體色為黑色（b），與之相對應(yīng)的野生型果蠅的體色為灰色（+），灰色對黑色為完全顯性，控制這對相對性狀的基因位于第二號(hào)染色體上；果蠅另一突變性狀為焦剛毛（sn），與之對應(yīng)的野生型性狀為直剛毛（+），控制這對相對性狀的基因位

6、于第一號(hào)染色體上，直剛毛對焦剛毛為完全顯性。用具有這兩對相對性狀的純合親本雜交，其性狀的遺傳行為應(yīng)符合自由組合定律。4. 生物某些性狀的遺傳常與性別聯(lián)系在一起，這種現(xiàn)象稱為伴性遺傳（sex-linked inheritance），這是由于支配某些性狀的基因位于性染色體上。果蠅屬XY型生物，共有四對染色體，第一對為性染色體，其余三對為常染色體。雌果蠅的性染色體構(gòu)型為某，、雄果蠅為XY?？刂乒壯凵幕蛭挥赬染色體上，在Y染色體則沒有與之相應(yīng)的等位基因。將紅眼（+）果蠅和白眼（w）果蠅雜交，其后代眼色的表現(xiàn)與性別有關(guān)。而且，正反交的結(jié)果不同。5. 不完全連鎖基因在形成配子時(shí)，隨同源染色體非姊妹染

7、色體單體之間發(fā)生交換而交換，產(chǎn)生一定頻度的重組型配子，在子代中表現(xiàn)一定比例的重組性狀，通過觀察和統(tǒng)計(jì)測交子代各種表型的個(gè)體數(shù)，可估算出連鎖基因間的交換率，由此確定基因在染色體上的相對位置，繪制出連鎖遺傳圖。已知果蠅（Drosophila melanogaster）的紅眼（+）對白眼（w）是顯性，直剛毛（+）對焦剛毛（sn）是顯性，長翅（+）對小型翅（m）是顯性，控制這三對相對性狀的基因都位于X染色體上，若將白眼（w）、焦剛毛（sn）、小型翅（m）三隱性突變體雌蠅（Xw sn mXw sn m）與紅眼（+）、直剛毛（+）、長翅（+）野生型雄蠅（X+Y）雜交，則F1可產(chǎn)生三雜合體雌蠅（Xw sn

8、mX+）和三隱性雄蠅（Xw sn mY）。由于Y染色體上不攜帶相應(yīng)的等位基因，因而表現(xiàn)出X染色體上三個(gè)隱性基因所控制的性狀，相當(dāng)于一個(gè)三隱性純合體。用F1代雜交（相當(dāng)于測交）,F2代表現(xiàn)出的8種表型及數(shù)目與F1雌蠅產(chǎn)生的8種配子及數(shù)目一致，通過觀察和統(tǒng)計(jì)F2代（相當(dāng)于測交子代）8種表型的個(gè)體數(shù)，就可估算出這三對基因間的交換率，由此確定這三對基因其在染色體上的相對位置，繪制出連鎖遺傳圖?！緦?shí)驗(yàn)材料】不同品系的黑腹果蠅；黑身果蠅（b）：黑體、紅眼、長翅、直剛毛（bb + + +）品系；三隱果蠅：灰體、白眼、小翅、焦剛毛（+ ww snsn mm）品系。實(shí)驗(yàn)用具、藥品：雙筒解剖鏡，鑷子，解剖針，毛筆

9、，白瓷板，吸水紙，培養(yǎng)箱，飼養(yǎng)瓶（指管），麻醉瓶，棉花，乙醚，酒精，丙酸，培養(yǎng)基等。【實(shí)驗(yàn)操作】（一）果蠅實(shí)驗(yàn)技術(shù)1. 麻醉：對果蠅進(jìn)行檢查時(shí)，用乙醚麻醉，使果蠅處于昏迷狀態(tài)。使用時(shí)將乙醚（23滴）滴到麻醉瓶的棉花球上（注意不要讓乙醚流進(jìn)瓶），麻醉瓶要保持干燥，否則會(huì)粘住果蠅翅膀，影響觀察。麻醉果蠅時(shí)，先將長有果蠅的培養(yǎng)瓶在海棉墊上敲，使果蠅全部震落在培養(yǎng)瓶底部，然后迅速打開培養(yǎng)瓶的棉塞，把果蠅倒入去蓋的麻醉瓶中，并立即蓋好麻醉瓶，待果蠅全部昏迷后，倒在白瓷板上進(jìn)行觀察。果蠅的麻醉程度看實(shí)驗(yàn)要求而定，對仍需培養(yǎng)的果蠅，以輕度麻醉為宜。但對不再培養(yǎng)，單單進(jìn)行性狀觀察的果蠅可以深度麻醉，甚至致死也

10、無妨（果蠅翅膀外展45°角，說明死亡）。檢查完畢后，把不需要的果蠅倒入盛有煤油或酒精或水的瓶中（死蠅盛留器）。2. 果蠅交配：將雌雄果蠅放在一起培養(yǎng)，雌蠅的生殖器中有貯精囊，可保留交配所得的大量精子，雌蠅一次交配所得的精子，足夠它多次排出的卵受精，因此在做雜交試驗(yàn)時(shí)，雌蠅必須選用處女蠅（沒有交配過的雌蠅）。雌蠅孵出后12小時(shí)不會(huì)交配，這個(gè)時(shí)間把果蠅全部倒出，分出雌雄蠅，單獨(dú)飼養(yǎng)，這時(shí)收集的雌蠅是處女蠅。雜交時(shí)把所需品系的雄蠅直接放到處女蠅培養(yǎng)瓶中，貼好標(biāo)簽，注明兩親本的基因型及交配日期，進(jìn)行培養(yǎng)。78天后倒掉親本（一定要倒干凈，以免親代和子代混淆），待F1成蠅羽化后開始計(jì)算，觀察性狀

11、?？煽康挠?jì)數(shù)及觀察是培養(yǎng)開始的20天以（再晚F2也可能有了）。若須繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，觀察F2，可在F1挑出雌雄數(shù)對，另外培養(yǎng)，因?yàn)檫@次是用F1作親本，進(jìn)行個(gè)體間互交，所以這時(shí)不是處女蠅也可以。但如要把F1雌蠅與另一品系雄蠅雜交時(shí)，還要嚴(yán)格地選取處女蠅，方法同上。3. 原種培養(yǎng)在作新的留種培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)事先檢查一下果蠅有沒有混雜，以防原種丟失。親本的數(shù)目一般每瓶510對，移入新瓶時(shí)，須將培養(yǎng)瓶橫臥，然后用毛筆將麻醉的果蠅從白瓷板上輕輕掃入，待果蠅醒過來后再把培養(yǎng)瓶豎起，以防果蠅粘在飼料上。原種每24周換一次培養(yǎng)基（依溫度而定，1015約4周換一次，2025約二周換一次）。每一原種培養(yǎng)至少保留兩套，培養(yǎng)瓶的標(biāo)

12、簽上要寫明突變名稱，培養(yǎng)日期等。作原種培養(yǎng)溫度可控制在1015，培養(yǎng)時(shí)避免日光直射。果蠅在適宜條件下會(huì)產(chǎn)子代，在肉眼能看到幼蟲時(shí)就可把親本倒掉，幾天以后，新的成蠅便產(chǎn)生。待成蠅有了足夠保種的數(shù)量后，要調(diào)換培養(yǎng)瓶，作為下一代的親本，繼續(xù)培養(yǎng)。原種果蠅培養(yǎng)遇到的麻煩是飼料發(fā)霉。發(fā)霉的原因很多，如用具沒有滅菌，空氣污染，親本不及時(shí)倒掉，都會(huì)引起飼料發(fā)霉。嚴(yán)重的霉菌污染會(huì)影響果蠅的生長。飼料中加丙酸可以抑制霉菌，但并不能完全制止。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中有少量霉點(diǎn)時(shí)可用燒過的解剖針挑出。若大量霉菌污染，可把果蠅全部倒在一個(gè)消毒過的空指管中，讓它活動(dòng)23小時(shí)，換一支指管，再活動(dòng)12小時(shí)，而后倒入一支新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)

13、培養(yǎng)，這樣可以防止霉菌污染。原種保存遇到的另一個(gè)問題是混雜，幾個(gè)不同品系的果蠅在一起培養(yǎng)，一定要防止混雜。培養(yǎng)瓶的塞子要做得緊些，不使果蠅逃出。調(diào)換培養(yǎng)瓶時(shí)，要防止果蠅飛散。外逃的果蠅要打死。發(fā)現(xiàn)了混雜的原種，要根據(jù)原種果蠅的全部特征，挑出數(shù)對雌雄蠅飼養(yǎng)，進(jìn)行篩選直到完全沒有分離為止。這樣做，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，只是在不得已時(shí)才采用。一般混雜時(shí)，只要方便，可以重新引種，將混雜種棄去。（二）果蠅雜交實(shí)驗(yàn)（1）果蠅的性狀觀察、性別鑒定及飼養(yǎng)。（2）選取雜交親本中所用的母本必須是處女蠅。剛羽化的雌蠅在12h一般無交配能力。在雜交前放出親本培養(yǎng)瓶中的所有成蠅，每隔1012h收集一次羽化的成蠅，并將雌雄蠅分開飼養(yǎng)

14、。收集處女蠅數(shù)量的多少根據(jù)需要而定。（3）麻醉接種 用黑身果蠅與三隱果蠅雜交，正反交同時(shí)進(jìn)行。即三隱×黑身，黑身×三隱。將所選處女蠅按品系分別麻醉，按不同雜交組合分別選取雌、雄蠅各610只移入雜交瓶中，為了防止昏迷果蠅被培養(yǎng)基粘住，可將培養(yǎng)瓶放倒，將果蠅置于瓶壁，待其醒后再將培養(yǎng)瓶直立，貼上標(biāo)簽：正交BBXw-m-snXw-m-sn´bbX+Y日期：某：反交bb X+ X+ ´ BBXw-m-snY日期：某：將雜交瓶放在2025恒溫箱培養(yǎng)。（4）培養(yǎng)78d，倒掉雜交親本（倒掉的果蠅最好處死）。（5）再過45d，F(xiàn)1代成蠅出現(xiàn)，觀察F1代性狀是否和預(yù)期結(jié)果

15、一致。（6）收集610對F1代果蠅放入一新培養(yǎng)瓶，在2025恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，以便觀察F2代（正反交作相同處理）。（7）繼續(xù)培養(yǎng)78d后，移去F1代。（8）再45d，F(xiàn)2代成蠅出現(xiàn)，開始觀察并統(tǒng)計(jì)F2代的性狀表現(xiàn)類型及數(shù)目?！窘Y(jié)果統(tǒng)計(jì)分析】（一）數(shù)據(jù)記錄正交灰體黑體合計(jì)紅、長、直162212475614263856白、小、焦118511543973623098白、長、直30926111377760紅、小、焦2642599996718紅、長、焦63492217151白、小、直81972636240紅、小、直311315127128881白、長、焦34124513175792體色合計(jì)78032693

16、10496性別合計(jì)4176362714761217性別合計(jì)56524844反交灰體黑體合計(jì)紅、長、直3558143711534816629白、小、焦1459141223131494白、長、直462052774352紅、小、焦731952662356紅、長、焦41883141201白、小、、小、直15731896125696白、長、焦612742677438體色合計(jì)7598270110299性別合計(jì)4094350414931208性別合計(jì)55874712（二）統(tǒng)計(jì)分析1.分離定律圖譜分析P: BB（灰體）×bb（黑體）F1: Bb(灰體)自交F2： BBBbb

17、b灰體 黑體理論 比值：3 ： 1實(shí)際 正交數(shù)量： 7803 2693 比值：2.90 ： 1 反交數(shù)量：75982701 比值： 2.81 ： 12檢驗(yàn)正交基因體色基因（B/b）F2表型灰體黑體合計(jì)實(shí)得數(shù)O7803269310496預(yù)期數(shù)E787226241049622.4192P（n=1）0.100.50(>0.05)（差異不顯著）反交基因體色基因（A/a）表型灰體黑體合計(jì)實(shí)得數(shù)7598270110299預(yù)期數(shù)7724.252574.751029928.2540P（n=1）<0.01（差異極顯著）2.自由組合定律圖譜分析正交：P: 灰體焦剛毛（BBXsnXsn）× 黑

18、體直剛毛（bbX+Y）F1: BbX+Xsn×BbXsnYF2： BBX+XsnBbX+XsnBBXsnXsnBbXsnXsnbbX+XsnbbXsnXsnBbX+Y BBX+Y BBXsnY BbXsnYbbX+YbbXsnY灰體直剛毛 黑體直剛毛灰體焦剛毛黑體焦剛毛理論比值：3 ： 1 ： 3 ：1實(shí)際數(shù)量：4243 14943560 1199 比值： 3.54 ： 1.25 ： 2.97 ： 1反交：P: 黑體直剛毛（bbX+X+）×灰體焦剛毛（BBXsnY）F1: BbX+Xsn ×BbX+YF2： BBX+X+BbX+X+BBX+XsnBbX+Xsnbb

19、X+XsnbbX+X+BbX+Y BBX+YBBXsnY BbXsnY bbX+YbbXsnY灰體直剛毛 黑體直剛毛 灰體焦剛毛 黑體焦剛毛理論 比值： 9 ： 3 ： 3 ： 1實(shí)際 數(shù)量： 580720031791698 比值： 8.32 ： 2.87 ： 2.57 ： 12檢驗(yàn)表型合計(jì)正交灰體直剛毛黑體直剛毛灰體焦剛毛黑體焦剛毛實(shí)得數(shù)424314943560119910496預(yù)期數(shù)393613123936131210496294.8463P（n=3）<0.01（差異極顯著）反交實(shí)得數(shù)58072003179169810299預(yù)期數(shù)5793.18751931.06251931.0625

20、643.687510299217.4544P(n=3)<0.01（差異極顯著）3.伴性遺傳圖譜分析正交 反交P：XwXw（雌白眼）×X+Y（雄紅眼） X+X+（雌紅眼）×XwY（雄白眼）F1: X+Xw（雌紅眼）× XwY（雄白眼） X+Xw（雌紅眼）× X+Y（雄紅眼）理論：1 ： 1 1 ： 1實(shí)際： 25 ： 16 30 ： 29F2：X+XwXwXwX+YXwY X+X+X+XwX+Y XwY 雌紅眼 雌白眼 雄紅眼 雄白眼 雌紅眼雄紅眼雄白眼理論 1 ： 1 ： 1 ： 1 2 ： 1 ： 1 實(shí)際 3069：2583 ：2537 ：23

21、075135 ： 2747 ： 19652檢驗(yàn)紅眼白眼合計(jì)正交F1表型雌雄雌雄實(shí)得數(shù)25001641預(yù)期數(shù)20.50020.54121.9756P（n=1）0.10.5(>0.05)（差異不顯著）F2表型雌雄雌雄合計(jì)實(shí)得數(shù)306925372583230710496預(yù)期數(shù)2624262426242624104962117.2880P(n=3)<0.01（差異極顯著）反交F1表型雌雄雌雄合計(jì)實(shí)得數(shù)30290059預(yù)期數(shù)29.529.5005920.0169P（n=1）0.50.95(>0.05)（差異不顯著）F2表型雌雄雌雄合計(jì)實(shí)得數(shù)51352747-19659847預(yù)期數(shù)492

22、3.52461.75-2461.7598472142.3761P（n=2）<0.01（差異極顯著）4.連鎖交換定律利用正交數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可知，表型+ + sn和w m +個(gè)體數(shù)目最少，應(yīng)是雙交換產(chǎn)物，由此可以推論，基因sn一定位于中間，而三基因的相對順序是w sn m三點(diǎn)測交結(jié)果統(tǒng)計(jì)F2表型數(shù)量比例重組發(fā)生在基因wsnsnmwm+ + +385666.25w sn m3098+ + m88115.94w sn +792+ sn m71814.08w + +760+ sn +1513.73w + m240總計(jì)10496117.8119.6630.02交換值圖距理論值w-m30.02+2

23、15;3.7337.4737.4734.6sn-m19.6619.6615.1w-sn17.8117.8119.5并發(fā)率1.07干擾-0.07染色體圖w sn m17.8119.6633.4理論連鎖圖w sn m15.10 19.6034.60【分析及討論】1.分離定律的驗(yàn)證：果蠅的體色是一對獨(dú)立遺傳的常染色體基因。對于這對基因來說，自身遵守分離定律，且正反交表型比率相同。但是針對實(shí)驗(yàn)得到表型比率來看，相差比較大。單因子適合度測驗(yàn)主要是來驗(yàn)證分離定律。在2適合度檢驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，正交的結(jié)果P值>0.05，說明實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)與理論的數(shù)據(jù)相差不大，支持最初的假設(shè)。但是對于反交來說，得到的P值<0.01，說明與孟德爾分離定律相差很大，不能夠用基因的回交來說明。2.自由組合定律的驗(yàn)證：果蠅的體色和剛毛是兩對獨(dú)立遺傳的基因，剛毛基因位于X染色體上。因此，對于這兩對基因來說，自身遵守自由組合定律，且F2正反交表型比率不同，通過圖譜分析，我們得到正交表型比率（灰體直剛毛： 灰體焦剛毛：黑體直剛毛：黑體焦剛毛）分別為3:3:1:1和9:3:3:1。在雙因子2適合度檢驗(yàn)中，正反交的結(jié)果P值均<0.01，與孟德爾自由組合定律相差很大。針對于以上單因子及雙因子2適合度檢驗(yàn)發(fā)生的現(xiàn)象，我認(rèn)為主要有以下兩個(gè)方