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1、虎杖方劑對(duì)四氯化碳致大鼠肝損傷的保護(hù)作用研究 【摘要】 目的觀察虎杖方劑對(duì)四氯化碳(CCl4)致大鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法參照方法制備CCl4致大鼠肝損傷模型,實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組、藥物對(duì)照組、CCl4肝損傷組、藥物預(yù)防組、藥物不同劑量組。測(cè)定肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)活性及血清一氧化氮(NO)與腫瘤壞死因子(TNF-)水平,并進(jìn)行肝組織學(xué)檢查。結(jié)果CCl4致大鼠肝損傷組肝組織SOD活性明
2、顯降低,MDA含量顯著升高(P<0.01);血清ALT、AST、AKP活性及NO與TNF-水平顯著升高(P<0.01)?;⒄确絼┍旧韺?duì)正常肝臟無(wú)損傷作用,而且虎杖方劑預(yù)防組與治療組均能明顯提高肝組織SOD活性,降低肝組織MDA含量;顯著降低血清ALT,AST,AKP活性及NO與TNF-水平(P<0.01)。肝組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)虎杖方劑能明顯減輕CCl4引起的肝組織及肝細(xì)胞損傷。結(jié)論虎杖方劑本身對(duì)肝組織無(wú)明顯損傷作用,通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制TNF-的表達(dá)和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能減輕CCl4引起的肝損傷。 【關(guān)鍵詞】 虎杖方劑 四氯化碳 肝損傷肝臟是機(jī)體主要的代謝器官,病毒性
3、肝炎、毒物、藥物等諸多因素可導(dǎo)致肝功能受損而影響其正常的代謝功能。肝功能出現(xiàn)障礙時(shí),對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)的清除能力下降,嚴(yán)重者甚至可引起肝昏迷?;⒄确絼┯上虒幨心仙礁尾⊙芯克鶜v經(jīng)數(shù)年收集民間治療肝病驗(yàn)方、經(jīng)方、單方、秘方根據(jù)中醫(yī)理論由虎杖、地榆、三白草等配伍蓬莪術(shù)按一定比例成方,用于防治病毒性乙型肝炎。本方劑中虎杖、莪術(shù)均有保肝護(hù)肝作用1,2。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子-(TNF-)等在肝損傷中起重要作用3,并且發(fā)現(xiàn)莪術(shù)在較大劑量時(shí)對(duì)肝有毒性作用4?;⒄鹊葘?duì)肝損傷時(shí)NO和TNF-的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。為了保證臨床用藥的安全性和有效性,本實(shí)驗(yàn)就該方劑對(duì)四氯化碳致大鼠肝損傷的保護(hù)
4、作用進(jìn)行了觀察。1 材料與方法1.1 動(dòng)物健康Wistar大鼠,體重180250 g,雌雄兼用。1.2 材料原生藥加蒸餾水浸泡1 h后,煎煮1 h和30 min兩次,合并煎液進(jìn)行濃縮,得濃度為含生藥100的溶液,冰箱保存;四氯化碳(CCl4),分析純,上海申鶴化學(xué)品有限公司產(chǎn)品,臨用前用麻油配成50的溶液;谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒,上海生物制品研究所產(chǎn)品;SOD,MDA試劑盒,南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品;NO,TNF-試劑盒,武漢博士德有限公司產(chǎn)品。1.3 實(shí)驗(yàn)分組參照文獻(xiàn)5方法建立大鼠肝損傷模型,60只Wistar大鼠分成6組,每
5、組10只。正常對(duì)照組以生理鹽水灌胃(1 ml/kg,2次/d,連續(xù)6 d);藥物對(duì)照組以藥物灌胃(1 ml/kg,2次/d,連續(xù)6 d);肝損傷組以50CCl4灌胃(1 ml/kg,1次/d,連續(xù) 3 d),第4天用生理鹽水灌胃(1 ml/kg,2次/d,連續(xù)6 d);藥物預(yù)防組為藥物灌胃(1 ml/kg,2次/d,連續(xù)6 d),第7天開(kāi)始用50CCl4灌胃(1 ml/kg,1次/d,連續(xù)3 d);藥物組以50%CCl4灌胃(1次/d)連續(xù)3 d,第4 d開(kāi)始用藥物灌胃(1.0 g/kg,2次/d,持續(xù)6 d);藥物組以藥物灌胃2 ml/kg,余同藥物組。1.4 生化測(cè)定與組織學(xué)觀
6、察所有動(dòng)物于末次處理后2 h斷頭處死、取血、分離血清,按試劑盒說(shuō)明用賴(lài)氏法測(cè)定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性;用磷酸苯二鈉法測(cè)定血清堿性磷酸酶(AKP)活性;用酶聯(lián)吸附免疫法測(cè)定血清TNF-水平;用硝酸還原酶法測(cè)定NO水平。同時(shí)取部分肝臟組織,用生理鹽水制成10的組織勻漿,按試劑盒說(shuō)明測(cè)定SOD活性及MDA含量,另取肝組織用10多聚甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色,在光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。2 結(jié)果2.1 虎杖方劑對(duì)CCl4肝損傷大鼠血清ALT,AST,AKP活性的影響肝損傷組血清ALT,AST及AKP水平明顯高于正常對(duì)照組(P<
7、;0.01),表明CCl4肝損傷模型制作成功。藥物對(duì)照組與正常對(duì)照組比較,血清酶活性無(wú)顯著性改變(P>0.05),提示在實(shí)驗(yàn)給藥劑量時(shí)藥物本身不引起肝臟明顯損傷,對(duì)正常肝功能無(wú)明顯影響。無(wú)論預(yù)防性用藥還是治療性用藥,均顯著降低血清ALT,AST及AKP活性(P<0.01),其中以降低AST與ALT作用更明顯,結(jié)果表明藥物對(duì)CCl4肝損傷大鼠肝臟有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 虎杖方劑對(duì)大鼠血清ALT、AST及AKP活性的影響(略)與正常對(duì)照組比較,1)P<0.01;與肝損傷組比較,2)P<0.011
8、 2.2 虎杖方劑對(duì)大鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影響肝損傷組SOD水平顯著降低,MDA水平明顯升高,藥物組和預(yù)防組均明顯降低SOD水平,降低MDA水平,提示藥物能通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用,減輕CCl4對(duì)肝臟的損傷。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 虎杖方劑對(duì)大鼠肝組織SOD活性及MDA含量的影響(略)與正常對(duì)照組比較,1)P<0.01;與肝損傷組比較,2)P<0.012.3 虎杖方劑對(duì)CCl4致肝損傷大鼠血清NO與TNF-水平的影響與正常組比較,肝損傷組血清NO和TN
9、F-水平顯著增高,治療組或預(yù)防組血清NO和TNF-水平均明顯降低,表明虎杖方劑保護(hù)CCl4引起的肝損傷與抑制NO合成和分泌,以及抑制TNF-的表達(dá)有關(guān),結(jié)果見(jiàn)表3。表3 虎杖方劑對(duì)CCl4致肝損傷大鼠血清NO與TNF-水平的影響(略)對(duì)照組比較,1)P<0.01;與肝損傷組比較,2)P<0.01,3)P<0.052.4 虎杖方劑對(duì)CCl4致肝損傷的組織學(xué)觀察光鏡下觀察,肝損傷組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊,肝索排列紊亂,肝細(xì)胞腫脹明顯,胞漿疏松,大部分肝血竇變窄,甚至閉塞不通,有淤血改變,壞死范圍大,呈橋狀或帶狀壞死。藥物治療組和預(yù)防組,病變較肝損傷組明顯減輕,肝細(xì)
10、胞輕度濁腫,病變僅限于肝小葉周邊區(qū),呈點(diǎn)狀或局灶樣壞死,多數(shù)肝血竇顯露,開(kāi)放通暢,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器數(shù)目和形態(tài)恢復(fù)接近正常,肝細(xì)胞增生活躍,雙核多見(jiàn)。3 討論 四氯化碳是一種對(duì)肝細(xì)胞有嚴(yán)重毒性作用的化學(xué)物質(zhì),在體內(nèi)經(jīng)代謝產(chǎn)生自由基CCl3-,通過(guò)自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用破壞肝細(xì)胞器(如細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線(xiàn)粒體、溶酶體、細(xì)胞核),導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死,轉(zhuǎn)氨酶大量漏出;同時(shí)四氯化碳可直接抑制肝臟微粒體混合功能酶6,7(如CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1和CYP2E1等),最終引起肝功能受損而降低。另外,在自由基的作用下,可激活單核細(xì)胞和巨噬
11、細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-)等,TNF-參與炎癥反應(yīng)直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。內(nèi)皮細(xì)胞在一氧化氮合酶(NOS)的作用下合成并分泌內(nèi)皮舒張因子一氧化氮(NO),合成NO的酶有兩種,即原生型和誘生型。原生酶合成的NO有舒張血管、傳遞信息、抑制血小板聚積等作用,而誘生酶合成的NO則與免疫及細(xì)胞毒有關(guān),造成組壞死和細(xì)胞死亡,進(jìn)一步加重肝損傷。有研究表明3,誘導(dǎo)型NOS是肝臟的主要形式,并且TNF-在肝臟炎癥反應(yīng)中起非常重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,虎杖方劑能明顯對(duì)抗CCl4引起的大鼠肝損傷,其保肝護(hù)肝作用系通過(guò)虎杖中的白藜蘆醇苷
12、和莪術(shù)中的莪術(shù)酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制TNF-的表達(dá)和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能產(chǎn)生,與報(bào)道的一致8,而且該方劑本身對(duì)肝臟無(wú)明顯損傷作用。本實(shí)驗(yàn)還觀察到預(yù)防給藥對(duì)肝臟雖有保護(hù)作用,但不及治療組,其原因系藥物在體內(nèi)經(jīng)代謝和消除而使藥效降低?!疚墨I(xiàn)】 1 楊溪琳. 虎杖的臨床應(yīng)用探析J. 云南中醫(yī)中藥雜志,2007,28(10):48.2 薛 嵐.中藥虎杖的藥理研究進(jìn)展J.中藥雜志,2000,25(11):651.3 曾令蘭,鄭曲波,羅端德,等.慢性肝炎及肝硬化患者一氧化氮與內(nèi)皮素和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶相互關(guān)系的研究J.臨床消化病雜志,1999,11(3):110.4 陳 斌,孫克偉,謝鳳英,等.莪術(shù)治療慢性肝損傷時(shí)的肝毒性作用研究J.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2003,13(1):20.5 劉曉麗,劉春霞,劉紅軍,等. 小鼠四氯化碳急性中毒性肝損傷模型制備方法探討J.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,18(1):30.6 陳小麗,周炯亮,楊杏芬,等. 四氯化碳抑制大鼠肝細(xì)胞色素P450同功酶的研究J.衛(wèi)生毒雜志,2000,14(4):214.7 Bruckner JV, Ramanathan R, Lee KM, et al. M
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