老年期癡呆患者腦脊液微管相關(guān)蛋白tau的檢測(cè)

1、    老年期癡呆患者腦脊液微管相關(guān)蛋白tau的檢測(cè)        【摘要】目的探討老年期癡呆（SD）患者腦脊液（CSF）中微管相關(guān)蛋白tau(以下簡(jiǎn)稱tau)的檢測(cè)方法。方法采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)26例SD患者和30例非神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的CSF-tau。結(jié)果兩者濃度分別為473±279、151±60 pg/ml，有極顯著差異（P<0.001）；本法靈敏度為53.8%,特異性為83.3%，檢出限60 pg/ml，組內(nèi)變異1.2

2、%5.9%,組間變異1.7%6.0%。結(jié)論采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)SD患者CSF-tau的濃度可為診斷SD提供有價(jià)值的參考依據(jù)。【關(guān)鍵詞】老年期癡呆腦脊液ELISAtau蛋白 老年期癡呆（SD）主要包括老年性癡呆（AD）和血管性癡呆（VD）。在歐美以前者多見，東方國(guó)家則以后者多見，我國(guó)尚無(wú)定論1,2。二者不同程度地存在有較多的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NFTs）,電鏡下的NFTs由雙股螺旋細(xì)絲（PHFs）組成，過(guò)度磷酸化的tau蛋白是PHFs的主要成份3。這種tau釋放到腦脊液(CSF)中可以用ELISA法檢測(cè)到。國(guó)外近年來(lái)已開展這方面的研究并有不少報(bào)道48。為探討SD的實(shí)驗(yàn)診斷方法，我們于199

3、8年6月起開展了ELISA法檢測(cè)SD患者CSF-tau的研究?，F(xiàn)將其檢測(cè)方法及結(jié)果介紹如下。1對(duì)象與方法1.1對(duì)象SD組26例(其中AD14例,VD12例),年齡4978歲,平均63±10歲;對(duì)照組30例,年齡4976歲,平均62±10歲。AD診斷全部符合美國(guó)NINCDC-ADRDA的“很可能是AD”的診斷標(biāo)準(zhǔn)9，哈金斯基缺血量表（HIS）得分5分，簡(jiǎn)易智能篩查表（MMSE）得分21分;VD診斷全部符合國(guó)際上的ICD-10-F01診斷標(biāo)準(zhǔn)，HIS7分，MMSE21分；對(duì)照組30例均為非神經(jīng)系統(tǒng)疾病手術(shù)行腰麻者，MMSE27分，頭顱CT證實(shí)無(wú)腦萎縮和腦梗死者。1.2方法120

4、）包被的酶標(biāo)微量滴定板；(2)凍干重組人tau蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，用前以500 l標(biāo)本稀釋液稀釋；(3)偶聯(lián)劑I：含兩種生物素化的單克隆抗人tau抗體（HT7和BT2120,液相抗體HT7和BT2，抗原為人tau蛋白。操作程序：所有試劑和標(biāo)本在用前置室溫平衡30 min；各種試劑按要求倍數(shù)稀釋；每份CSF各取0.2 ml按12用標(biāo)本稀釋液稀釋備用；在每一滴定孔內(nèi)加入偶聯(lián)劑75 l,隨后加入標(biāo)準(zhǔn)品tau(標(biāo)準(zhǔn)管)、標(biāo)本稀釋液（空白對(duì)照管）、稀釋好的標(biāo)本（待測(cè)管）各25 l，使每孔反應(yīng)體積均為100 l；混勻，parafilm密封，置25孵育過(guò)夜；拋干孔后洗板4次；加入偶聯(lián)劑100 l，混勻，密封，25孵

5、育40分鐘；拋干洗板4次；加入TMB顯色液100 l，25孵育30分鐘；加入終止液100 l，置酶標(biāo)儀450 nm，空白孔調(diào)零后讀取2次A值，取其均數(shù)為結(jié)果。依標(biāo)準(zhǔn)tau濃度梯度和相應(yīng)A值求±s)表示，組間比較F檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1CSF tau回歸方程標(biāo)準(zhǔn)孔tau和A值見表1。將表1數(shù)據(jù)代入=a+bX，得出tau的回歸方程為tau=3507.88×A-40.135。表1標(biāo)準(zhǔn)管tau和A值管號(hào)123456tau(pg/ml)1200600300150750A 值0.3600.1680.8100.5300.50002.2各組CSF tau濃度見表2。 表2各癡呆組與對(duì)照組CSF

6、-tau比較(±s)組 別CSF-tau含量（pg/ml） AD(n=14)483.3±285.7*VD（n=12）461.0±288.7*SD(n=26)473.0±279.5*對(duì)照組(n=30)151.3±60.4與對(duì)照組比較*P<0.01,*P<0.001 2.3本檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)參數(shù)(1)靈敏度和特異性：以對(duì)照組tau ±2s(151.3+2×60.4=272.1 pg/ml）為界值，判斷本法靈敏度和特異性分別為53.84%、83.33%。(2)檢出限與回收率：以12次測(cè)試標(biāo)本稀釋液的平均A值+4s為檢出限

7、下限，59.9 pg/ml,回收率 92.16%。(3)實(shí)驗(yàn)變異：組內(nèi)1.2%5.9%，組間1.7%6.0%。3討論本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心（AT120與HT7/BT2）ELISA法檢測(cè)CSF-tau抗原，所測(cè)tau為CSF總tau,包括正常微管相關(guān)蛋白tau和過(guò)度磷酸化的tau。正常情況下tau存在于神經(jīng)元內(nèi)，尤以軸索中豐富，其生理功能主要與胞漿或軸漿運(yùn)輸有關(guān)，可能的機(jī)理是通過(guò)提高微管的穩(wěn)定性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而微管的一個(gè)主要作用是胞漿或軸漿運(yùn)輸3。正常tau與AD病人的tau（PHFs-tau）在聚合、磷酸化、微管結(jié)合和裝配能力以及糖基化等方面有很大差異，后者為過(guò)度磷酸化和糖基化的tau，由于其微管結(jié)

8、合區(qū)的自我結(jié)合導(dǎo)致了其對(duì)微管穩(wěn)定性作用的喪失，微管穩(wěn)定性的喪失則導(dǎo)致了其運(yùn)輸功能的障礙，進(jìn)而造成了神經(jīng)纖維及神經(jīng)元的變性和壞死。當(dāng)神經(jīng)元崩解后，tau釋放到CSF中。因此，檢測(cè)CSF-tau可以間接反映神經(jīng)元變性、壞死和軸索崩解情況。但目前只能檢測(cè)CSF總tau，尚無(wú)法單獨(dú)檢測(cè)過(guò)度磷酸化tau。在1998年，日本的Kanai等7人用同一種試劑盒檢測(cè)了276例病人和對(duì)照者CSF，其結(jié)果為AD 489±298，VD 267±146，NC 217±128，靈敏度 40%，特異性86.0%。從Kanai資料與本資料的結(jié)果看，兩組結(jié)果相近，可見本法有較好的可重復(fù)性和可靠性。

9、盡管癡呆的人口比例不斷上升，人們對(duì)癡呆的認(rèn)識(shí)也不斷深化，但癡呆的生前診斷仍停留在臨床量表水平，早期依靠客觀的檢測(cè)手段診斷仍很困難。我們采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)SD患者CSF-tau可以為生前診斷SD提供一個(gè)有價(jià)值的生物學(xué)參考指標(biāo)。作者單位：王琨（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院221002）沈霞（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院221002）丁新生（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）程虹（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）姚娟（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）鄧曉萱（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）參 考 文 獻(xiàn)1，高素榮主編. 癡呆診療學(xué). 第1版. 北京: 北京科學(xué)技術(shù)出版社,1998.22，Kokmen E,Beard CM,O'

10、;Brein PC,et al. Is the incidence of dementing illness changing? Neurology，1994，43:18873，盛樹力主編. 老年性癡呆.從分子生物學(xué)到臨床診治. 第1版.北京: 科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1998.1884，Vandermeeren M，Mercken M,Vanmeche E,et al.Delection of tau proteins in normal and Alzheimer's disease cerebrospinal fluid with a sensitive sandwich enzym

11、e-linked immunosorbant assay.J Neurol Chem，1993,61:18285，Arai H，Terajima M,Miura M，et al. Tau in cerebrospinal fluid:A potential diagnostic maker of Alzheimer's disease. Ann Neurol，1995,38:6496，Blennow K，Wallin A，Agren H，et al. Tau protein in cerebrospinal fluid: A biochemical marker of axonal d

12、egeneration in Alzheimer's disease. Mole Chem Neuropathol，1995,26:2317，Kanai M，Matsubara E，Isoe K，et al. Longitudial study of cerebrospinal fluid levels of tau、A1-40 and A1-42(43) in Alzheimer's disease: A study in Japan. Ann Neurology，1998,44:178，John Q，Trojanowski A，Christopher M，et al. Elevated levels of tau in cerebrospinal fluid:implications for the antemortem diagnosis of Alzheimer's disease.Alzheimer's Disease Review，1996,1:779，Mckham G，Drachman D，F(xiàn)olstein M,et al. Clinical diagnosis of Alzh