轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究應(yīng)用.docxVIP

1、轉(zhuǎn)墾因11物疫苗的Qi君應(yīng)用任寶忠（塔城地區(qū)動物疾病控制與診斷中心.新洲塔城834/00）疫苗是能使人或其他生物獲得主動免疫的含有死的或減毒的微生物（病原菌）。利用特定的死的或活的病原體，或者用致病力很弱的病原體所生毒素?；蛘哂貌≡w分泌的其他物質(zhì)作為抗原，以誘導(dǎo)人體或牲畜形成特定抗體、對特定疾病產(chǎn)生免疫活性、從而預(yù)防該病的發(fā)生和流行。應(yīng)用常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)疫苗存在著抗原來源困難、有副作用、不安全等問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種基因工程疫苗的研究異?；钴S，其中，轉(zhuǎn)基因植物疫苗是除了微生物裁體疫苗和轉(zhuǎn)基因動物疫苗以外的又一種頗有吸引力和較為經(jīng)濟(jì)的基因工程疫苗。轉(zhuǎn)基因植物是一種多樣化、可再生和低成

2、本的新型分子材料。將抗原基因構(gòu)建在植物表達(dá)裁體E,利用農(nóng)桿菌或者基因槍介導(dǎo)方法，將抗原基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中并與植物基因組整合，獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。通過動物采食后，達(dá)到使動物獲得免疫保護(hù)的目的。一、轉(zhuǎn)基因植物疫苗的免疫原理轉(zhuǎn)基因植物疫苗可誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，小腸淋巴組織的黏膜上有一種侍殊的細(xì)胞叫做膜細(xì)胞（M細(xì)胞mastcells）黏膜免疫應(yīng)答就是由M細(xì)胞識別抗原開始的。M細(xì)胞能與抗原結(jié)合，然后抗原經(jīng)胞飲被攝入細(xì)胞再由吞飲泡轉(zhuǎn)送至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步降解，未經(jīng)降解的抗原則運(yùn)送至上皮區(qū)。M細(xì)胞識別抗抗原并將其傳遞給巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞（APC細(xì)胞）再將抗原展示給輔助性T細(xì)胞，輔助性T細(xì)胞

3、識別外源白質(zhì)片段后就會刺激B細(xì)胞制造和釋放能中和抗原的抗體，當(dāng)疾病因子出現(xiàn)時，記憶輔助性T細(xì)胞剌激細(xì)胞毒T細(xì)胞攻擊受感染的細(xì)胞，同時它迅速刺激記憶B細(xì)胞分泌中和抗體消滅入侵的病原體，總的來說，轉(zhuǎn)基因植物疫苗可以誘導(dǎo)相應(yīng)的血清型的IgA和IgG反應(yīng)。二、轉(zhuǎn)基因植物疫苗優(yōu)勢與常規(guī)疫苗相比較，轉(zhuǎn)基因植物疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢：（1）使用方便?？芍苯邮秤?，無需注射器，避免r繁瑣的免疫程序，易于推廣。（2）生產(chǎn)成本低廉，易于大規(guī)模生產(chǎn)。只需要消耗陽光、肥料和水，部分疫苗表達(dá)于可食組織，可以直接口服接種，節(jié)省r提取、純化和保存的成本，又便于長距離運(yùn)輸。（3）安全性好。在用動物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的過程中可能會污染動物

4、病毒，這對人類具有潛在的危害性。轉(zhuǎn)基因植物只表達(dá)亞單位疫苗，不受動物病毒污染，對人畜安全。（4）能進(jìn)行有效的翻譯后加工。植物細(xì)胞具有與動物細(xì)胞相似的翻譯后加工過程，包括糖基化、磷酸化和酰胺化等，可保持自然狀態(tài)下的免疫原性。（5）有效啟動黏膜免疫反應(yīng)。植物細(xì)胞壁的存在訶以抵抗肖酸、胰蛋白酶以及其它消化酶對抗原蛋白的直接消化，使其在小腸中逐漸樺放，利于激起較強(qiáng)的黏膜免疫反應(yīng)。（6）轉(zhuǎn)基因植物疫苗是可以通過宜接口服的給藥方式進(jìn)行人體免疫的，能誘發(fā)黏膜和全身免疫應(yīng)答，而且是安全有效的。三、轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究應(yīng)用現(xiàn)狀目前，已有多種植物疫苗在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)成功，且在動物和人體實(shí)驗(yàn)中獲得了滿意的結(jié)果，為

5、傳染病預(yù)防英定了一定的基礎(chǔ)。（-）乙型肝炎疫苗Mason等于1992年首次報道了采用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的方法在煙草中表達(dá)重組乙肝病毒表面抗原（IIBsAg）.從轉(zhuǎn)基因植株中純化出的HBsAg,經(jīng)過負(fù)染，在電鏡下觀察到HBsAg顆粒，平均直徑為22nm,與人血清中的類似。2002年，Smith等苗次用大豆和煙草的巷浮細(xì)胞表達(dá)HBsAg,并對抗原在懸浮細(xì)胞內(nèi)積累的動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。利用免疫金標(biāo)記的方法，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在懸浮細(xì)胞內(nèi)HBsAg也積聚形成病毒樣顆粒。2003年,SunilKumar等也在轉(zhuǎn)基因煙簞懸浮細(xì)胞中表達(dá)了HBsAg,并H首次在慈浮細(xì)胞培養(yǎng)液中也檢測到了HBsAg。這是有

6、關(guān)HBsAg顆粒植物細(xì)胞外分泌的首篇報道。2005年,Thanavala等在有商業(yè)HBsAg疫苗接種史的志愿者（入選志愿者抗2HBs抗體<115mIU/ml）中進(jìn)行雙肓安慰劑對照臨床試矣，評估土互表達(dá)的HBsAg的免疫原性。結(jié)果表明，食用轉(zhuǎn)基因土豆3個劑最后，62.5%的志愿者血清中抗2HBs抗體的滴度升高，最高者達(dá)4785mIU/ml,而食用作轉(zhuǎn)基因上豆者未見升高，表明轉(zhuǎn)基因植物乙肝口服疫苗是安全有效的。郝浩永等用農(nóng)桿萌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)HBsAg基因的番茄植株，ELISA檢測和Westernblotting證實(shí)HBsAg已在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)，分子晶:約為24kD,與ShulgaNY等在馬鈴

7、羿中表達(dá)的HBsAg相似。郝浩永，尉亞怦等認(rèn)為植物系統(tǒng)可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后修飾，使抗原保持天然免疫原性，有效激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。（二）口蹄疫病毒疫苗口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）所引起的一種強(qiáng)烈性的傳染病，主要感染偶蹄獸，如豬、牛、羊等。WigdorovitzA等將FMDVVP1基因轉(zhuǎn)化到苜請中，VP1基因能在苜請中有效表達(dá)，用葉片提取物或直接飼喂試驗(yàn)動物，均可產(chǎn)生特異抗體。CarrilloC等將FMDVVP1插入到馬鈴薯表達(dá)載體中，VP1基因在馬鈴募中能有效表達(dá)，用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯來飼喂試驗(yàn)動物，能夠產(chǎn)生抗FMDV的特異性抗體。1999年wigdrroriz等將FEDV結(jié)構(gòu)蛋白基因V

8、P1成功插入到煙草花病毒（TMV）Ul基因組，接種煙草，用葉子提取物做免疫試凝，也檢測到免疫原性，能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。與同時進(jìn)行的VP1轉(zhuǎn)基因肯蓿的實(shí)驗(yàn)想必有更好的對FMDV免疫應(yīng)答保護(hù)率。中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所經(jīng)過反復(fù)篩選，利用煙草花葉病毒研制成一種安全性很高的新型口蹄疫疫苗。該所科研究人員從煙草中提取大甘攜帶11肽、14肽重組的TMV病罹顆粒，用研制成口蹄疫疫苗并將該疫苗在模式動物豚鼠和乳鼠身上進(jìn)行免疫效率的測定。豚鼠免疫試驗(yàn)和乳鼠保護(hù)試驗(yàn)顯示，這種疫苗具右良好的免疫性，在接受動物體內(nèi)可激發(fā)出較高水平的中和抗體，抵抗病毒的入侵。（三）霍亂毒素疫苗霍亂毒素（CT）是由A亞基（CT

9、-A）與五聚體的B亞基（CT-B）組成，CT-B與腸道黏膜細(xì)胞表面特異的神經(jīng)節(jié)皆脂結(jié)合而引起腹瀉。Arakawa等使CT-B基因在馬鈴普中得到表達(dá)，用其塊莖飼喂小鼠，在血清和糞便中均檢測到了特異抗體，表明這種馬鈴薯具有良好的免疫原性。（四）狂犬病毒糖蛋白McGarveyPB等報道了狂犬病病毒糖蛋白在番茄中表達(dá)，能與單克隆抗體起交叉反應(yīng)。ModelskaA等將狂犬病病毒外表的-種械賀白的部分肽段與一種植物病毒的衣殼徵白融合后在植物中表達(dá)，直接飼喂小鼠后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)比飼喂純化的疫苗引起的反應(yīng)還要強(qiáng)烈。MeGarvey等用轉(zhuǎn)基因番茄表達(dá)狂犬病（Rabies）抗原（G盅白），經(jīng)PCR檢測證實(shí)基因

10、整合成功。Modelska等用工程植物病毒（含有狂犬病抗原的重組育?；ㄈ~病毒顆粒）感染菠菜提取物，對小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，受試小鼠均產(chǎn)生局部和系統(tǒng)免疫反應(yīng)。（五）傳染性胃腸炎病毒傳染性肖腸炎?。═GEV）是-種冠狀病毒,可引起人畜肖腸炎。用表達(dá)TGEV糖蛋白S末端的轉(zhuǎn)基因馬鈴磐塊莖飼喂小鼠，ELISA檢測小鼠血清產(chǎn)生了特異抗體，抗體滴度高于腹腔注射免疫。TubolyT等用轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的TGEV糖蛋白S比Go-mezN等報道的高出510倍，用轉(zhuǎn)基火I煙草免疫小豬，通過ELISA檢測和病毒中和試照發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了抗TGEV的特異免疫反應(yīng)，但水平很低。（六）復(fù)合口服疫苗復(fù)合疫苗是指-種植物疫苗可以同時抵抗兒種不

11、同的疾病。Yu和Langridge在2001年研究了寢亂毒素A2亞單位（CTA2）和B亞單位（CTB）分別融合了兩中不同的抗原。密亂毒素包括一個2亞基，5個B亞基以及一個短序列（A2）,A亞基上有毒素激活區(qū)域，短序列則把這1個A亞基和5個B亞基連接在一起。Yu和Langridge成功構(gòu)建了一個復(fù)合結(jié)構(gòu)輪狀病毒腸毒素（NSP4）與CTB融合在一起，腸毒素大腸桿菌菌毛抗原（CFA/I）與CTA2融合在-起。并旦他們在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中表達(dá)了這個頂合抗原。連續(xù)56d每天5次用3g轉(zhuǎn)基因馬鈴篝（平均包括10g的復(fù)合抗原）飼養(yǎng)小鼠，可以引起體系免疫和黏膜免疫應(yīng)答，同時可抵抗霍亂病毒（CT）,輪狀病毒（RV）

12、,腸毒素大腸桿倘（ETEC）。而且研究中還發(fā)現(xiàn)，NSP4抗原的存在還可以誘導(dǎo)一種特別的T細(xì)胞反應(yīng)。四、轉(zhuǎn)基因植物疫苗存在的問題及對策存在的問題.如疫苗在植物中的表達(dá)量和穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗的免疫有效性，其中就有植物疫苗免疫原性弱和保護(hù)效果差，不能夠刺激胃腸黏膜免疫系統(tǒng)，受體植物的選擇和生物安全性，植物特異的多糖是糖蛋白表達(dá)的問題。（一）提高植物疫苗的表達(dá)水平為使外源抗原基因更好地在植物中得以高水平表達(dá)，可對目的基因進(jìn)行各種修飾，如，優(yōu)化密碼子，優(yōu)化抗原表位，添加增強(qiáng)子或前導(dǎo)序列，添加修飾基因或吸附基因（如M細(xì)胞等）使抗原直接靶向免疫系統(tǒng)等；為消除目的基因轉(zhuǎn)化后的沉默現(xiàn)象，在構(gòu)建表達(dá)栽體時

13、，盡最降低目的基因與植物基因組的同源性，對多基因結(jié)構(gòu)采用不同的啟動子和polyA序列，或在轉(zhuǎn)基因的側(cè)冀接上核基質(zhì)結(jié)合序列以避免位置效應(yīng)；用52氮胞喘處理植株，可以抑制甲基化和脫甲基化的作用I選用強(qiáng)啟動子如來源于花郵菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動廣，可增強(qiáng)目的蛋白在葉片中的表達(dá)水平；選用組織特異性啟動子，如番茄果實(shí)特異性啟動了二玉米種子特異性啟動子、馬鈴磐塊莖啟動子等，可使目的蛋白在植物的特定部位集中表達(dá)，將疫苗蛋白定靶于細(xì)胞的不同部位，如線粒體、葉綠體、液泡和油體等活躍的細(xì)胞器，甫提高蛋白表達(dá)水平和免疫效價；應(yīng)用含融合抗原基因的植物病毒載體去感染植物的特定部位（一般為葉片），可使外源基因隨

14、病毒的白發(fā)夏制而在植物體內(nèi)增殖，瞬時高效表達(dá)抗原蛋白。（二）轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗的免疫原性弱目前，多數(shù)可飼疫苗的免疫抗體水平和保護(hù)率低，顯然作為可飼疫苗是不理想的。為了增強(qiáng)抗原蛋白的免疫原性，叮實(shí)行免疫原基因與大腸埃希菌熱敏腸毒素B亞基（LTB）或霍亂曲素B亞基黏膜佐劑基因融合表達(dá)；構(gòu)建多基因表達(dá)載體來表達(dá)多種免疫原蛋白；另外，蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞中的折您、糖基化、蛋白質(zhì)裂解等過程需進(jìn)一步研究。高等植物對蛋白質(zhì)的折登和組7AaXeX*A*妨7A（上接7頁）綜合素質(zhì)教育證書和專項(xiàng)技能證書等。（四）能創(chuàng)新佳木斯大學(xué)把動物醫(yī)學(xué)專業(yè)人才培養(yǎng)目標(biāo)提升到要使學(xué)生“能創(chuàng)新”的高度來認(rèn)識。制定“能創(chuàng)新”人才培養(yǎng)計(jì)劃

15、以實(shí)現(xiàn)大學(xué)生知識、能力與創(chuàng)新能力發(fā)展為出發(fā)點(diǎn)，既考慮學(xué)生在校期間應(yīng)獲得的知識結(jié)構(gòu)與框架，又考慮學(xué)生各種專業(yè)能力、創(chuàng)新能力的培養(yǎng)和個性的發(fā)展。鼓勵動物醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生積極參加課外獸醫(yī)方面科研和裝過程已被證明同哺乳動物很相似，但植物與動物細(xì)胞間蛋白糖基化的不同是-個需要認(rèn)真解決的問題，對于大多數(shù)糖蛋白，正確的糖基化是發(fā)揮其生物活性必不可少的，植物糖基化模式與動物糖基化模式的不同是否會影響其抗原結(jié)合性、特異性或過敏性，目前還未見詳細(xì)報道，有待進(jìn)一步研究。（三）口服時抗原的消化降解重組世白在經(jīng)歷胃腸消化酶的作用后，可能發(fā)生降解或破壞，從而影響其免疫原性。為了防止口服時被消化降解，可使用保護(hù)植物米白免受降解

16、的佐劑或在抗原基因附近加上一些修飾基因或吸附基因序列來保護(hù)口服疫苗不被退速消化，從而可長時間停留在消化系統(tǒng)內(nèi)。（四）蛋白的提純植物外源蛋白的提取和純化技術(shù)到目前為止還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，如何進(jìn)行重組蛋白大規(guī)模的提取與純化還需要進(jìn)一步研究。融合表達(dá)一方面可提高外源蛋白的表達(dá)量，另一方面可簡化蛋白的提取和純化過程，是解決蛋白提純的-條有意義的途徑。（五）免疫耐受免疫耐受的產(chǎn)生對疫苗的作用顯然是致命的，大最動物實(shí)裁的結(jié)果顯示，機(jī)體對食實(shí)踐等活動，并根據(jù)所取得的成果和科研工作的表現(xiàn)折合成相應(yīng)的學(xué)分或成績。動物教研室對停醫(yī)專業(yè)重要的課程試矣和實(shí)習(xí)獨(dú)立設(shè)置課程實(shí)矣，對驗(yàn)證性試驗(yàn)的數(shù)最加以控制并適當(dāng)增加綜合性

17、和設(shè)計(jì)性的試驗(yàn)內(nèi)容。另外，課程試驗(yàn)多與畜禽生產(chǎn)實(shí)際相結(jié)合。通過長期規(guī)范的課程試驗(yàn)課教學(xué)可以進(jìn)一步培養(yǎng)、發(fā)展學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)、試驗(yàn)技能和創(chuàng)造性，并有助于學(xué)物的口服免疫耐受性與免疫系統(tǒng)的抑制性T淋巴細(xì)胞（Ts）的功能密切相關(guān)。參與口服耐受性的Ts細(xì)胞是CD+8T淋巴細(xì)胞，其表面的T細(xì)胞受體可能是a6TCR,遷移至腸系膜淋巴結(jié)后進(jìn)入全身淋巴系統(tǒng)。當(dāng)黏膜免疫系統(tǒng)遇到食物蛋白時通常產(chǎn)生口服免疫耐受，因此某些疫苗管理者提出食用轉(zhuǎn)基因植物疫苗可能會產(chǎn)生免疫耕受。所以有必要對口服疫苗本身進(jìn)行免疫耐受試驗(yàn)，找到避免口服免疫耐受的最佳:免疫方案。五、展望轉(zhuǎn)基因植物疫苗在目前還存在一系列的問題，但他的前紋是美好的。轉(zhuǎn)基因植物疫苗能夠減少注射疫苗的免疫，減少畜牧行業(yè)每年