實(shí)驗(yàn)1細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)及觀察實(shí)驗(yàn)2紅細(xì)胞膜滲透性觀察

1、 實(shí)驗(yàn)1: 細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)及觀察 實(shí)驗(yàn)2: 紅細(xì)胞膜滲透性觀察實(shí)驗(yàn)十實(shí)驗(yàn)十 細(xì)胞融合與血紅細(xì)胞滲透性的觀察細(xì)胞融合與血紅細(xì)胞滲透性的觀察實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1 1 細(xì)胞融合操作與觀察細(xì)胞融合操作與觀察 細(xì)胞融合（cell fusion）又稱細(xì)胞雜交（cell hybridization），是指在自然條件或利用人工（生物的、物理的、化學(xué)的）方法，使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合成一個(gè)具有雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象。此雜交細(xì)胞具有很強(qiáng)的生命力，增殖旺盛。 細(xì)胞融合術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)等研究的一重要手段，也是制備單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的重要技術(shù)。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饧?xì)胞融合的原理、意義；了解細(xì)

2、胞融合的方式；初步掌握聚乙二醇法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)方法。 在誘導(dǎo)物（如仙臺(tái)病毒，聚乙二醇）作用下，細(xì)胞發(fā)生凝集，隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化，主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排，最后打通兩質(zhì)膜，形成雙核或多核細(xì)胞（此時(shí)稱同核體或異核體）。二、細(xì)胞融合基本原理二、細(xì)胞融合基本原理同核體 同一個(gè)體（基因型相同）的親本細(xì)胞異核體 不同個(gè)體（基因型不同）的親本細(xì)胞細(xì)胞融合的意義細(xì)胞融合的意義 我們知道，無論是遠(yuǎn)緣雜交還是利用多倍體技術(shù)都要先實(shí)現(xiàn)有性雜交，而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間雜交往往表現(xiàn)為雜交不親和或不能受精或是胚胎早期敗育?？朔h(yuǎn)緣雜交中的不親和障礙；優(yōu)良性狀改良；組合起各種植物的優(yōu)良遺傳性狀

3、，從而培育出理想的新品種。進(jìn)行體細(xì)胞融合就可以避開生殖細(xì)胞的受精過程。在親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的物種間實(shí)現(xiàn)建基因轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造出自然界沒有的新物種。馬鈴薯和番茄通過細(xì)胞融合得到了至今有性雜交未能獲得的屬間雜種薯番茄和番茄薯；白菜和甘藍(lán)通過細(xì)胞融合得到白菜甘藍(lán)。實(shí)例實(shí)例細(xì)胞融合方式細(xì)胞融合方式 自發(fā)產(chǎn)生 人工誘導(dǎo)產(chǎn)生 生物法：滅活的病毒 化學(xué)法：聚乙二醇(PEG） 物理法: 電融合n 很多種類的病毒能介導(dǎo)細(xì)胞融合,如仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒、牛痘病毒等，其中仙臺(tái)病毒最常用。這類病毒的被膜中有融合蛋白，可介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞融合，也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞融合。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或-丙內(nèi)酯滅活，使病

4、毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。n 優(yōu)點(diǎn)：融合率較高，對各種動(dòng)物細(xì)胞都適宜，且仙臺(tái)病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)。n 缺點(diǎn)：病毒不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會(huì)降低，并且制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)對細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾。方式一：病毒誘導(dǎo)融合方式一：病毒誘導(dǎo)融合方式二：化學(xué)誘導(dǎo)融合方式二：化學(xué)誘導(dǎo)融合 n 很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合，如聚乙二醇（PEG）、 二甲亞砜、甘油、山梨醇等。n 這類物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂分子排列的改變，在去除作用因 素之后，質(zhì)膜恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復(fù)過程中由于 接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親合和表面張力，使相接觸 的細(xì)胞發(fā)生融合。n 優(yōu)缺點(diǎn)：使用

5、起來很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較 高，但是它有一定毒性，對有些細(xì)胞（如卵細(xì)胞）不 適用。n 20世紀(jì)80年代建立起來的電融合技術(shù)，是將兩種細(xì)胞的混合液置于低壓交流電場中，細(xì)胞極化成偶極子，排列成串珠狀，然后施加瞬間強(qiáng)脈沖，使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，從而導(dǎo)致融合。n 具有融合的頻率高，具有對細(xì)胞無毒害作用、操作簡便、作用機(jī)制明確、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但難以控制一對細(xì)胞的融合。 方式三：電融合方式三：電融合電融合儀聚乙二醇法的原理聚乙二醇法的原理聚乙二醇 (Polyethylene glycol，PEG) ：化學(xué)結(jié)構(gòu)HO(CH2CH2O)nH ，無色無臭粘稠液體至蠟狀固體，溶于水、乙醇和許多其它有機(jī)

6、溶劑，具有良好的水溶性，無毒、無刺激性。原理：PEG分子能改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親合以及彼此的表面張力作用，使細(xì)胞發(fā)生融合。優(yōu)點(diǎn)：成本低、異核率高、不受物種限制。影響融合率的因素影響融合率的因素 分子量分子量大，促融合能力越高； 濃度濃度越低，越易操作，毒性越低； 融合時(shí)間30 s120 s； pH值一般以稍堿性為宜（7.4-8.0）。 兼顧融合率、PEG毒性和黏度，通常選用相對分子質(zhì)量10004000，濃度在30%50%的PEG。 三、細(xì)胞融合的應(yīng)用三、細(xì)胞融合的應(yīng)用微生物原生質(zhì)體融合構(gòu)建新菌株植物原生質(zhì)體融合和

7、培養(yǎng)技術(shù)培育新植物（薯番茄/番茄薯）動(dòng)物細(xì)胞融合用于研究核質(zhì)關(guān)系、繪制染色體基因圖譜、制備單克隆抗體、研究腫瘤發(fā)生機(jī)制等領(lǐng)域。1. 器具: 顯微鏡、離心機(jī)、離心管、細(xì)滴管、載片、蓋片2. 試劑: Alsever液：葡萄糖2.05 g，檸檬酸鈉0.8 g，NaCl 0.42 g，加重蒸水至100 mL。GKN 液：NaCl 8 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4.2H2O 1.77 g，NaH2PO4.2H2O 0.69 g，葡萄糖2 g，酚紅0.01 g，溶于1 L重蒸水中。0.85% NaCl液 50%聚乙二醇(PEG)：稱取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度試管，在酒精燈火或沸水

8、中加熱溶化。待冷至50時(shí)，加入等體積并預(yù)熱至50的GKN液混勻。四、實(shí)驗(yàn)用品四、實(shí)驗(yàn)用品五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法1.用注射器取2 mL Alsever液，再從翼下靜脈取鴨血2 mL，注入管內(nèi)，再加6 mL Alsever液，混勻后置4冰箱中備用。2.實(shí)驗(yàn)時(shí)取“步驟1”液1 mL于離心管中，加入4 mL 0.85%的NaCl液，混勻平衡后，以1200 rpm/min離心5分鐘。3.棄上清液。再重復(fù)“步驟2”兩次，最后一次離心10分鐘。4.在沉降血球中加入1 mL GKN液，混勻使之成為細(xì)胞懸液。5.用40 m濾膜過濾細(xì)胞懸液。6.取0.1 mL“5”液于1.5 mL離心管中，用于對照

9、；剩余“5”液于另一1.5 mL離心管中，加入6-8滴（約0.5 mL）50%的PEG液，迅速混勻，常溫下2-3 min滴片鏡檢。 在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的鴨血細(xì)胞膜融合在一起，形成一個(gè)融合細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的鴨血細(xì)胞。六、結(jié)果觀察與分析六、結(jié)果觀察與分析融合率的計(jì)算融合率的計(jì)算作業(yè)：描述顯微鏡下細(xì)胞融合的變化，計(jì)算融合率。 在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。 細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，它可選擇性地讓某些物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。而對

10、于不同性質(zhì)的物質(zhì)，細(xì)胞膜的通透性是大不一樣的。當(dāng)細(xì)胞與所處的環(huán)境存在滲透壓差別時(shí)，水分子可從滲透壓低的一側(cè)向高的一側(cè)擴(kuò)散，以至于在高滲環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)失水而皺縮；而在低滲環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)吸水膨脹直至破裂。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)2 2、紅細(xì)胞膜滲透性觀察、紅細(xì)胞膜滲透性觀察一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)器械及試劑二、實(shí)驗(yàn)器械及試劑顯微鏡，燒杯，試管，載玻片，蓋玻片，兔血，1.5% NaCl溶液，蒸餾水等。三、三、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟(一)兔紅細(xì)胞滲透壓的觀察1.取一小燒杯，用肝素液（1 mg/mL生理鹽水）濕潤，然后加入兔血，以10倍生理鹽水稀釋，制成兔血細(xì)胞懸浮液.2.取5支試管，編碼后依次向各試管加入1.5% NaCl溶液5, 3, 2, 1, 0 mL,然后分別加入蒸餾水，使每管總體積達(dá)到5 mL，配成一濃度梯度的NaCl溶液。3.向每一試管加入0.5 mL兔紅細(xì)胞懸浮液，混勻。試管編號(hào)試管編號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1.5% NaCl1.5% NaCl（mlml） 5 3 2 1 05 3 2 1