誘導(dǎo)型一氧化氮合酶與動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)

1、    誘導(dǎo)型一氧化氮合酶與動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)        摘要目的：探討誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在血液動(dòng)力學(xué)調(diào)控中的作用。方法：本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為健康、雄性、Dahl 鹽敏感（DS）及Dahl鹽不敏感（DR）大鼠，體重(190±4) g。通過慢性血液動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察靜脈輸入誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抑制劑AG對(duì)大鼠平均動(dòng)脈壓的影響。此外，本實(shí)驗(yàn)還測(cè)定了一氧化氮（NO）終產(chǎn)物NO2及NO3含量以及鈣依賴及鈣不依賴的NOS活性以了解iNOS的功能。結(jié)果：（1）iNOS特異抑制

2、劑AG對(duì)正常血壓（包括高鹽或低鹽輸入的Dahl鹽抵抗大鼠及低鹽輸入的Dahl鹽敏感大鼠）沒有明顯影響，但能明顯放大高鈉引起的DS大鼠的血壓上升效應(yīng)；（2）高鹽在導(dǎo)致的DS大鼠血壓升高的同時(shí)，能引起iNOS活性的明顯升高。結(jié)論：iNOS是參與血液動(dòng)力學(xué)調(diào)控的重要組成部分，尤其是在血壓處于較高水平時(shí)，iNOS具有不容忽視的調(diào)節(jié)作用。主題詞一氧化氮； 血壓；大鼠；氯化鈉中分類號(hào)R544.1文獻(xiàn)標(biāo)示碼A 文章編號(hào)1000-4718(2000)05-0397-04 Inducible nitric oxide synthase and arterial pressure regulationCHENG

3、Shao-bing, TAN Dun-yong， CHEN Xiao-lin，YANG Hao-zhuang, ZHANG Sui-mei, YAN Liang(Dept. of Pathophysiology, Jinan University Medical College, Guangzhou 510632, China)AbstractAIM and METHODS：To clarify the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the regulation of blood pressure，in the presen

4、t study, we examined the effect of aminoguanidine (AG), a selective inhibitor of iNOS on the hemodinamical response of Dahl salt-sensitive (DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats to low (0.3%) or high (8%) sodium chloride (NaCl) infusion by chronical in vivo hemodynamic experiment, and the effect of

5、NaCl or NaCl plus AG infusion on urinary nitrate (NO3)/nitrite (NO2), the end product of nitric oxide (NO), excretion by Greiss Reaction. Furthermore, NOS activity assay was also carried out to probe the effect of NaCl and AG on calcium-dependent or independent NOS activity in renal tissue. RESULTS:

6、1. High or low NaCl-infused DR rats and low NaCl-infused DS rats have no hemodinamical response to AG, however, the hypertensive effect of high NaCl (8%) infusion on DS rats were greatly amplified by co-infusion of AG. 2. Administration of high NaCl significantly elevated the iNOS activity of renal

7、tissue, and greatly increased urinary NO3/NO2 excretion. CONCLUSION:Inducible NOS is an important modulator of arterial pressure, especially in case of higher blood pressure.MeSHNitric oxide； Blood pressure； Rats； Sodium chloride一氧化氮（nitric oxide,NO）具有強(qiáng)大的擴(kuò)血管作用，體內(nèi)NO的合成由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NO

8、S）催化底物精氨酸（L-arginine, L-Arg）的氨基上的N與分子氧（O2）結(jié)合生成。目前已經(jīng)證明至少存在3種NOS，即內(nèi)皮型NOS（eNOS）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS）及神經(jīng)型NOS（nNOS）13。雖然大量的研究表明eNOS在血液動(dòng)力學(xué)中具有極其重要的調(diào)節(jié)作用，但有關(guān)iNOS在血液動(dòng)力學(xué)中的作用卻知之甚少。我們以前的工作表明，高鹽能刺激大鼠NO的生成及iNOS蛋白的明顯增加，由此我們推測(cè)iNOS在維持正常血壓尤其是在某些高血壓因素的影響下將血壓維持在一定的范圍內(nèi)起著極為重要的作用。本研究主要觀察長(zhǎng)期靜脈給予iNOS抑制劑aminoguanidine (AG)后,對(duì)大鼠血壓的影響。材

9、料和方法一、慢性在體血液動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)78周齡（體重190±4g）、雄性Dahl鹽敏感（Dahl salt sensitive, DS）或不敏感（Dahl salt resistant, DR）大鼠，禁食（但自由飲水）1820 h，經(jīng)苯巴比妥鈉（60 mg/kg b w, ip）麻醉后，行腹主動(dòng)脈及股靜脈插管術(shù)，然后兩導(dǎo)管經(jīng)皮下自頸后部引出并與一雙導(dǎo)管旋轉(zhuǎn)活結(jié)（Swival，Instech,Plymouth Meeting,PA）相連，以使動(dòng)物可自由活動(dòng)而不致導(dǎo)管扭轉(zhuǎn)打結(jié)。手術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)1星期開始實(shí)驗(yàn)，置于代謝籠并保持室內(nèi)溫度恒定、環(huán)境安靜及以日光燈模仿白天/黑夜周期（12 h:12 h

10、），并隨機(jī)分為8組（n=6）：DR低鹽(NaCl)、DR低NaClAG、DR高NaCl、DR高NaClAG、DS低NaCl、DS低NaClAG、DS高NaCl、DS高NaClAG。動(dòng)脈導(dǎo)管經(jīng)旋轉(zhuǎn)活結(jié)及壓力轉(zhuǎn)換器（Cobe, Lakewood,CO）后與生理記錄儀（model 7D, Grass Instruments,Quincy, MA）相連，其血液動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)一模/數(shù)（A/D）轉(zhuǎn)換裝置轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)后輸入計(jì)算機(jī)處理、儲(chǔ)存及分析。收集實(shí)驗(yàn)最后24 h尿液測(cè)定其nitrite/nitrate濃度。二、Nitrate/nitrite測(cè)定NO的代謝終產(chǎn)物尿中nitrate/nitrite（UNOx

11、）含量測(cè)定使用Greiss反應(yīng)及E.coli還原酶（使NO-3還原為NO-2）。試驗(yàn)中所收集的尿液樣品于70儲(chǔ)存。測(cè)定時(shí)，將樣品與E.Coli nitrate還原酶于37孵育90 min后離心取上清。0.2 mL上清加入0.4 mL Greiss試劑顯色，并以分光光度計(jì)于543 nm波長(zhǎng)測(cè)定并計(jì)算NO-2及NO-3總濃度4,5。三、一氧化氮合酶活性測(cè)定慢性在體血液動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)完畢后，大鼠經(jīng)過量注射苯巴比妥鈉處死后，迅速取出腎髓質(zhì)并置于干冰冷凍。剪碎后以組織勻漿器勻漿，勻漿液組成：250 mmol/L sucrose, 1 mmol/L EDTA, 0.1 mmol/L PMSF, and 5 m

12、mol/L potasium phosphate, pH 7.7。 NOS分析時(shí)，將組織勻漿加入下述液體進(jìn)行孵育：2 mmol/L CaCl2，1 mmol/L NADPH, 25 mol/L FAD, 1.25 g/mL鈣調(diào)素（calmodullin）, 10 mol/L四氫吡啶（tetrahydrobiopterin）, 及3H-L-arginine ( 300 000 counts/min, s a. 2.52×1012Bq/mmol) in 20 mmol/L HEPES buffer, pH 7.2, 于37孵育5 min。 在上述液體中加入0.5 mmol/L EDTA并

13、去除Ca2+及calmodullin測(cè)定Ca2+不依賴的NOS活性。結(jié)果一、NaCl及AG對(duì)平均動(dòng)脈壓的影響如1所示，鹽濃度的改變對(duì)Dahl 賴鹽大鼠（DR）的平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）幾乎沒有影響。輸入0.3%及8NaCl的大鼠組，其第10 d的MAP分別為(12.28±0.17)及(12.07±0.16) kPa。在輸入0.3或8NaCl的同時(shí)，輸入iNOS特異抑制劑AG，其MAP亦基本無變化。但在輸入0.3或8NaCl的Dahl鹽敏感的大鼠，輸入8NaCl后，其MAP明顯升高，輸入0.3及8NaCl溶液組，輸入10 d后的MAP

14、分別為(12.43±0.40)及(18.83±0.13) kPa。若在輸入鹽溶液的同時(shí)輸入AG（12.3 mg.kg-1.h-1）能顯著放大高鹽引起的MAP升高，輸入AG后第10 d，MAP為(21.49±0.23) kPa。二、NaCl及AG對(duì)nitrate/nitrite的影響從表1可以看出，不同鹽溶液輸入對(duì)DR大鼠NO代謝終產(chǎn)物nitrate/nitrite基本沒有影響。輸入0.3及8鹽溶液的DR大鼠，其nitrate/nitrite生成量分別為3 456±234及3 564±210 nmol/24 h。在0.3NaCl+AG及8NaCl

15、+AG組DR大鼠，其nitrate/nitrite生成量分別為3 103±212及3 098±123 nmol/24 h,說明無論在高鹽或低鹽情況下輸入AG對(duì)DR大鼠NO生成均無明顯影響。與此相反，高鹽輸入能明顯增加DS大鼠nitrate/nitrite生成，輸入0.3及8NaCl的DS大鼠，其nitrate/nitrite生成量分別為3 543±231及13 298±432 nmol/24 h。同時(shí)輸入AG（12.3 mg.kg-1.h-1）幾乎完全抑制高鹽刺激NO生成的效應(yīng)（表1）。Low NaClLow NaCl+AG Hi NaCl Hi NaC

16、l+AGDR Rats3 456±234 3 103±2123 564±210 3 098±123DS Rats 3 543±231 3 104±225 13 298±432*4 098±342#     *P0.01, vs low NaCl infused group； # P0.01, vs group infused high NaCl alone; DR： Dahl Salt-Resistent； DS:Dahl Salt-Sensitive 三、NaCl及AG對(duì)鈣

17、依賴NOS及鈣不依賴NOS活性的影響由于eNOS及nNOS的活性依賴Ca2+的存在，而iNOS則為Ca2+非依賴的NOS，本實(shí)驗(yàn)中，我們利用反應(yīng)液中Ca2+、calmodullin及EDTA的有無得以測(cè)定鈣依賴NOS（eNOS及nNOS）及鈣不依賴NOS活性（iNOS）。 NOS活性分析表明，0.3%及8NaCl后，DR大鼠腎組織鈣依賴的NOS及鈣不依賴的NOS活性均基本無改變（表2）。0.3及8NaCl輸入后，鈣依賴的NOS的活性分別為8 650±908及8 775±678，鈣不依賴的NOS的活性分別為3 455±322及4 522±302。而在DS大

18、鼠，高鹽能明顯升高鈣依賴的及鈣不依賴的NOS的活性，0.3及8NaCl輸入后，鈣不依賴的NOS活性分別為4 233±554及35 698±1 380。同時(shí)給予AG后則能顯著抑制鈣不依賴的NOS活性的升高（表2）。表2NaCl、AG對(duì)大鼠腎組織Ca2+ 依賴及Ca2+Calcium-dependent NOSCalcium-independent NOS DSDRDS DRLow NaCl6 571±786 8 650±9084 233±5543 455±322 High NaCl8 987±2 432* 8 775±

19、;67835 698±1 380*4 522±302 High NaCl+AG6 421±1 987# 7 242±90810 985±2 345#4 109±444     * P0.05,*P0.01, vs low NaCl infused rats; # P0.05, # P0.01, vs high NaCl infused rats 討論為探討iNOS在動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)中的作用，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)觀察了給Dahl鹽敏感（DS）及Dahl鹽不敏感（DR）大鼠長(zhǎng)期靜脈輸入AG后平均動(dòng)脈壓的變化情況。

20、結(jié)果如1所示，DR大鼠，輸入0.3及8NaCl后MAP沒有顯著改變。輸入NaCl的同時(shí)，給予AG對(duì)MAP亦無影響。輸液10 d后，DRlow NaCl及DR+High NaCl組大鼠的MAP分別為(12.28±0.17)及(12.07±0.16) kPa。但在DS大鼠，8NaCl則能顯著升高M(jìn)AP。DSLow NaCl及DShigh NaCl組的MAP分別為(12.43±0.40)及(18.83±0.13)kPa。若同時(shí)給予AG，能明顯放大NaCl的升血壓效應(yīng)。給予8NaCl及AG（12.3 mg*kg-1*h-1）組大鼠的MAP由單純給予8NaCl時(shí)的

21、(18.83±0.13)升高到(21.49±0.23)kPa。這一結(jié)果提示iNOS可能在血壓升高時(shí)被激活，iNOS可能在相對(duì)較高的血壓時(shí)才起作用。血壓本身可能是iNOS的有效刺激因素。     iNOS最早在大鼠巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，且能被細(xì)菌感染迅速激活生成大量NO以發(fā)揮其免疫殺傷作用。大量報(bào)道表明，iNOS不僅存在于免疫系統(tǒng)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞亦存在大量iNOS，提示iNOS對(duì)血管張力、血液動(dòng)力學(xué)可能具有不容忽視的調(diào)節(jié)作用69。此外，與eNOS及nNOS不同，iNOS一旦被某種因素激活，能在很短的時(shí)間內(nèi)生成高于平時(shí)上千倍的NO6,7。這一點(diǎn)為

22、iNOS參與高血壓情況下血管張力的調(diào)節(jié)，從而使血壓不再繼續(xù)升高奠定了酶學(xué)基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎組織等部位存在的eNOS及iNOS在血液動(dòng)力學(xué)調(diào)控中可能有不同的分工。一般情況下（血壓正常時(shí)），正常血管張力及動(dòng)脈血壓的維持可能以eNOS為主，因而Dahl鹽不敏感的大鼠(DR)以及給予低鹽的Dahl 鹽敏感的大鼠（DS），其NO的生成相對(duì)恒定（表1），同時(shí)此時(shí)給予AG以阻斷iNOS的活性，而血壓并不上升（1）。但在高血壓等病理情況下，由eNOS所產(chǎn)生的NO不足以維持血管的正常張力時(shí)，iNOS得以激活，并產(chǎn)生相對(duì)大量的NO以使血壓不致惡性升高。從表2可以看出，在高鹽刺激下，DS大鼠腎組織eNOS及iN

23、OS活性均升高，但以iNOS的升高更為明顯，并可見NO合成釋放大幅度升高。本工作證實(shí)，iNOS是參與血液動(dòng)力學(xué)調(diào)控的一個(gè)重要組成部分。尤其是在血壓處于相對(duì)較高水平時(shí)，iNOS可能起著不容忽視的作用。有關(guān)iNOS在血壓較高被激活的機(jī)制、與血壓之間量的關(guān)系以及其他類型的高血壓與iNOS的關(guān)系等，值得進(jìn)一步探討?；痦?xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金（No.39870359）及教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助程少冰（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 廣東 廣州 510632）譚敦勇（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 廣東 廣州 510632）陳小琳（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 廣東 廣州 510632）楊皓莊（

24、暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 廣東 廣州 510632）張穗梅（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 廣東 廣州 510632）顏亮（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 廣東 廣州 510632）參考文獻(xiàn)1Blottner D. Nitric oxide and fibroblast growth factor in automatic nervous system: short and long term messengers in automatic pathway and target organ controlJ. Prog Neurol， 1997, 51:423438.2Taylor-Ro

25、binson AW. Counter-regulation of T-helper 1 cell proliferartion by nitric oxide and interleukin-2J. Biochem Bioph Res Commun， 1997, 233:1419.3Rees D, Ben-Ishay D, Moncada S. Nitric oxide and the regulation of blood pressure in the hypertensive-prone and hypertension resistant Sabra ratJ. Hypertension，1996, 28: 367371.4Tan DY, Cernadas MR, Aragoncillo PA,et al. Role of nitric oxide-related mechanisms in renal function in ageing ratsJ. Nephrol Dial Transplant， 1998, 13:594601.5Tan DY, M