RNA干擾載體的構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)流程規(guī)范

1、RNA干擾載體的構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)流程 RNA干擾載體主要用來(lái)研究基因表達(dá)調(diào)控，RNA干擾技術(shù)已已被廣泛用于基因結(jié)構(gòu)功能研究和傳染性疾病及基因治療領(lǐng)域，進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)首先是構(gòu)建RNA干擾載體，本文以pRI系列載體為例論述了干擾載體的構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)流程。產(chǎn)品技術(shù)背景pRI系列載體是基于III類(lèi)rna聚合酶啟動(dòng)子：人類(lèi)H1啟動(dòng)子的專(zhuān)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA干擾的載體。H1啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)合成類(lèi)似siRNA分子的小分子RNA。由于H1啟動(dòng)子有精確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止信號(hào)，H1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物精確生成人工設(shè)計(jì)的shRNA，shRNA經(jīng)過(guò)RISC剪切后形成有2個(gè)U突出末端的成熟siRNA。由于H1啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄

2、產(chǎn)物長(zhǎng)度的嚴(yán)格限制，基本上杜絕了非特異性干擾片段的產(chǎn)生，將載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對(duì)其它基因的影響降到最低。pRI系列載體已經(jīng)成功用于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因的RNA干擾。本系列中含有新霉素抗性基因的載體用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA，可以在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)基因表達(dá)抑制后的細(xì)胞功能和生理現(xiàn)象進(jìn)行觀(guān)察和分析。插入寡核苷酸設(shè)計(jì)pRI系列載體的使用需要將人工設(shè)計(jì)的寡核苷酸片段插入pRI系列載體中特定的酶切位點(diǎn)之間，寡核苷酸片段中包含了針對(duì)目標(biāo)基因的mRNA設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度為19nt的干擾片段。合成時(shí)需要化學(xué)合成正向和反向兩條寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后與載體連接，插入載體XhoI，BglII位點(diǎn)之間，位于載體上H1啟動(dòng)子下

3、游正確的位置上。連接后的載體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞在H1啟動(dòng)子作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA。1.  選擇干擾序列在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，RNA干擾序列的選擇會(huì)顯著影響RNA干擾效果。我們建議您按照以下幾點(diǎn)指導(dǎo)原則選擇RNA干擾序列：推薦長(zhǎng)度為19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。RNA干擾序列中不包含大于3 nt的連續(xù)相同堿基。RNA干擾序列的GC含量為低到中等水平(推薦GC含量在35%到50%之間)。不要將RNA干擾序列設(shè)計(jì)在已知的RNA-蛋白質(zhì)結(jié)合位置附近。確保RNA干擾序列與其它基因沒(méi)有較高的同源性。方向：在編碼mRNA的正義鏈上選擇RNA干擾序列。設(shè)計(jì)RNA干擾序列是RNAi實(shí)

4、驗(yàn)的關(guān)鍵。這里提供的設(shè)計(jì)原則可以為您設(shè)計(jì)RNA干擾序列提供幫助。但是，值得注意的是，遵循這些原則不能確保設(shè)計(jì)的RNA干擾序列對(duì)目標(biāo)基因有好的抑制效果。針對(duì)一個(gè)目標(biāo)基因，我們建議您至少設(shè)計(jì)3條干擾序列并且從中篩選出干擾效果好的序列。2.  寡核苷酸設(shè)計(jì)。（1）設(shè)計(jì)正義寡核苷酸鏈(5-3方向)。a) 5TCGACCCb) 19nt干擾序列正向序列(與目標(biāo)mRNA一致)。c) TTCAAGAGA(環(huán)狀結(jié)構(gòu))。d) 19nt干擾序列的反向互補(bǔ)序列。e) TTTTT。（2）設(shè)計(jì)反義寡核苷酸鏈(5-3方向)。a) 去掉正義鏈寡核苷酸中5TCGAb) 將步驟a)中得到的序列做反向互補(bǔ)。c) 在步驟

5、b)中得到的序列的5端加上堿基GATC。一個(gè)設(shè)計(jì)好的例子見(jiàn)下圖：實(shí)驗(yàn)流程概述：以下為使用pRI載體的方法概述。1.  將合成的正義和反義寡核苷酸鏈退火。2.  用BglII和XhoI雙酶切載體。3.  將退火的寡核苷酸鏈與酶切后的線(xiàn)性載體連接。4.  連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。5.  轉(zhuǎn)染細(xì)胞。6.  觀(guān)測(cè)熒光表達(dá)(含有GFP的載體)或篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞(含有抗性的載體)。7.  檢測(cè)目標(biāo)基因蛋白或mRNA表達(dá)水平載體構(gòu)建對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的很多步驟，您可以使用您實(shí)驗(yàn)室中常用的方法，或者您的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)證實(shí)有效的方法。對(duì)于酶切、DNA純化以及

6、轉(zhuǎn)化等步驟，您可以參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行，也可以參照您購(gòu)買(mǎi)的試劑盒中生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行。步驟1：退火寡核苷酸鏈根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，脫鹽純化的寡核苷酸足以滿(mǎn)足連接和克隆需要。但是不同供應(yīng)商提供的引物純度差別很大，如果您連接和克隆遇到困難，可以考慮換用PAGE純化或HPLC純化的引物，或者使用其他供應(yīng)商提供的引物。用水將寡核苷酸稀釋為100 M。按以下體系配制退火反應(yīng)體系：正義寡核苷酸(100 M) 5 l反義寡核苷酸(100 M) 5 lNaCl 100 mMTris-Cl pH7.4 50 mM加水補(bǔ)足 50 l將配制好的退火反應(yīng)緩沖液重復(fù)混合，短暫離心后放置PCR以上，運(yùn)行以下程序：90

7、 4 min，70 10 min，55 10 min，40 10 min，25 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20 長(zhǎng)期保存。步驟2：酶切載體用XhoI和BglII雙酶切2 g載體。酶切方法和體系參照您購(gòu)買(mǎi)的內(nèi)切酶說(shuō)明書(shū)或者按照您的實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣的方法進(jìn)行。通常情況下用大約20-30單位的酶在大約3小時(shí)可以酶切完全。酶切后我們建議用瓊脂糖凝膠回收線(xiàn)性化載體。將回收后的載體體積稀釋為30 l。對(duì)線(xiàn)性化的載體進(jìn)行去磷酸化處理是沒(méi)有必要的。充分酶切后的載體具有不匹配的末端，一般不會(huì)發(fā)生載體自連。步驟3：連接載體用水將退火后寡核苷酸稀釋100倍備用。按照以下體系配制連接反應(yīng)體系：T4

8、DNA 連接酶 5 U線(xiàn)性化載體 2 l稀釋后寡核苷酸 2 l10×連接酶Buffer 1 l加水補(bǔ)足 10 l接連反應(yīng)條件和時(shí)間參照您購(gòu)買(mǎi)的連接酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為了減少空載體自連，連接反應(yīng)完成后，在連接反應(yīng)體系中加入1 l BglII，37 反應(yīng)30 min，切割連接上的空載體。(選做)步驟4：轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)用連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。市場(chǎng)上常見(jiàn)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(例如Top10，DH5-)均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制備感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法按照供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)或者您實(shí)驗(yàn)室中常用的方法進(jìn)行。在氨芐抗性的瓊脂平板上37 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后細(xì)菌，大約14-16小時(shí)后，

9、平板上出現(xiàn)單個(gè)細(xì)菌菌落。挑取多個(gè)菌落至氨芐抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。鑒定方法可以采用PCR鑒定或酶切鑒定。PCR鑒定采用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和M13R-48(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)進(jìn)行鑒定，空載體擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為308 bp，陽(yáng)性克隆擴(kuò)增產(chǎn)物為361 bp。酶切鑒定采用HindIII和EcoRI雙酶切?？蛰d體酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度為235 bp，陽(yáng)性克隆酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度為288 bp。鑒定正確的克隆可以用引物M13R-48測(cè)序驗(yàn)證插入的寡核苷酸序列是否正確無(wú)誤。步驟5：轉(zhuǎn)染細(xì)胞pRI系列載體可用常用的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。包括：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體

10、轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染等。您可以購(gòu)買(mǎi)市售的商品化轉(zhuǎn)染試劑并且參照供應(yīng)商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。步驟6：觀(guān)測(cè)GFP熒光和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系篩選如果細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，并且您使用了帶GFP的載體，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的不同，在轉(zhuǎn)染后3-5天能在熒光顯微鏡下觀(guān)察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。請(qǐng)注意，綠色熒光蛋白的表達(dá)表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功，不能說(shuō)明RNA干擾實(shí)驗(yàn)成功。如果您使用了帶有真核抗性標(biāo)簽如Neo-R的載體，這時(shí)您可以加入合適濃度的相應(yīng)藥物如G418進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選。步驟7：檢測(cè)RNA干擾效率您可以在蛋白水平或mRNA水平檢測(cè)RNA干擾效率。一般情況下蛋白的表達(dá)變化與mRNA水平的表達(dá)變化一致， 也有少數(shù)情況下mRNA表達(dá)水平變化不及蛋白表達(dá)下降明顯。為檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，您可以使用Western-Blot。為檢測(cè)mRNA表達(dá)情況，您可以使用逆轉(zhuǎn)錄+Realtime PCR或Northern-B