記憶障礙動物模型的制備及熟地黃對其的影響

1、記憶障礙動物模型的制備及熟地黃對其的影響         【摘要】  目的探討熟地黃的益智作用及其機理。方法對化學(xué)藥品所致記憶障礙模型小鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶行為實驗并檢測相關(guān)指標(biāo)，實驗動物隨機分為5組，分別為:正常對照組、模型組、腦復(fù)康組(500 mg/kg) 、熟地高劑量組(9 g/kg) 、熟地低劑量組(4.5 g/kg)。結(jié)果熟地黃能夠減少模型動物跳臺訓(xùn)練期、測驗期錯誤反應(yīng)次數(shù)并延長測驗期觸電潛伏期；縮短模型小鼠尋找平臺時間，并增加其跨臺次數(shù)；降低模型小鼠腦內(nèi)膽堿酯酶活性、Al3+含量，保護(hù)腦組織；并能使

2、腦內(nèi)Glu/GABA維持在正常水平。結(jié)論熟地黃對于化學(xué)藥品所致記憶障礙模型小鼠具有增強其學(xué)習(xí)記憶和空間記憶能力的作用，其作用機制可能與改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，降低腦內(nèi)Al3+含量，保護(hù)腦組織及維持腦內(nèi)Glu/GABA的正常水平有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  熟地黃 學(xué)習(xí)記憶 記憶障礙模型Abstract:ObjectiveTo study the nootropic effect of prepared Radix Rehmanniae and its related mechanism.MethodsThe behavior changes of learning and memory

3、disorder induced by dysmnesia were observed on mice, related indexes were detected as well.Mice were divided into five groups randomly:normal group, control group, piracetam group, prepared Radix Rehmanniae (PRR) high-dose group, PRR low-dose group.ResultsPRR could decrease the rate of mistake durin

4、g training and test period, prolong the latent phase, reduce the latency of searching platform. ConclusionPrepared Radix Rehmanniae can improve the ability of learning and memory of alzheimer mice induced by dysmnesia. The mechanism may be related to reducing brain cholinesterase activity, inhibitin

5、g the accumulation of aluminium ions in brain, maintaining the normal level of Glu/GABA.Key words:Prepared Radix Rehmanniae;  Learning and memorizing;  Dysmnesia   學(xué)習(xí)記憶屬于高級神經(jīng)活動，其基本過程可以大致分為獲得（acquisition）、鞏固（consolidation）和再現(xiàn)（retrieval）三個階段1。學(xué)習(xí)和記憶既是腦的高級功能，又是極復(fù)雜的神經(jīng)活動過程，相應(yīng)的，學(xué)習(xí)記憶障礙的產(chǎn)

6、生機制也十分復(fù)雜，涉及神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)、神經(jīng)藥理學(xué)、神經(jīng)生化學(xué)、行為藥理學(xué)等多學(xué)科的內(nèi)容。根據(jù)記憶過程的生理生化基礎(chǔ)，在進(jìn)行益智藥物研究中，通常在訓(xùn)練前或訓(xùn)練后不同時間給予動物采用一些化學(xué)藥物，造成各種記憶障礙模型。此種模型較正常動物更能正確反映藥物的作用，從而可用于益智藥物的篩選或初步分析其作用機理。   鋁元素具有神經(jīng)毒性，鋁中毒腦病在引起記憶障礙的同時，還導(dǎo)致神經(jīng)元染色衰變而變性死亡，誘導(dǎo)神經(jīng)纖維退行性變性，并引起ChAT活性降低，Ach，5-HT，NA含量下降2。因此，用慢性鋁中毒方法復(fù)制學(xué)習(xí)記憶障礙模型較為理想，不但可以通過行為學(xué)實驗直觀地觀察藥物的益智作用

7、，而且能進(jìn)一步從影響學(xué)習(xí)記憶的多種因素探索其作用機理。   熟地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥塊莖經(jīng)加工炮制而成,功能補血滋陰,益精填髓。臨床中,熟地黃是治療老年健忘、記憶力減退的常用藥3,同時,也是治療小兒先天不足、腦髓空虛之呆鈍,成人腎陰虛之善忘的首選藥物之一。我們前期的藥理實驗4即從記憶的獲得、鞏固、再現(xiàn)三方面入手，分別采用跳臺法訓(xùn)練前10 min腹腔注射東莨菪堿4 mg/kg 制備記憶獲得障礙小鼠模型，24 h后測試；跳臺法訓(xùn)練后皮下注射亞硝酸鈉120 mg/kg制備記憶鞏固障礙小鼠模型，24 h后測試；跳臺法訓(xùn)練

8、5 min，24 h后測試前30 min灌胃40%乙醇0.1 ml/10 g制備記憶再現(xiàn)障礙小鼠模型。通過這些記憶障礙模型觀察熟地黃對記憶的不同階段的作用，結(jié)果表明熟地對上述模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力具有明顯的改善作用?？梢?，此行為實驗結(jié)果為熟地具有補腎生髓，益智健腦作用提供了一定的客觀依據(jù)。我們進(jìn)一步對熟地黃對AlCl3所致記憶障礙模型小鼠記憶力的影響及其機理進(jìn)行了研究。現(xiàn)報道如下。1  材料與方法1  材料1.1  試劑與藥品三氯化鋁 (AlCl3 ) ,廣東臺山化工廠；乙酰膽堿酯酶（AchE）試劑盒,總蛋白試劑盒,南京建成生物工程研究所提供。谷氨酸(Glu) ,

9、北京邦定泰克生物技術(shù)公司提供；氨基丁酸(GABA),(Sigma產(chǎn)品)，上海試劑公司提供。 熟地黃, 地黃Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥塊莖,購自河南省武陟縣藥材公司,一等品,按中國藥典(2000 年版,部)酒燉法制成熟地黃，水煎，過濾，濃縮至11，4 保存?zhèn)溆?。腦復(fù)康:東北制藥總廠,研成粉末,1%吐溫-80助溶,生理鹽水配制成25 mg/ml 藥液備用。1.2  動物昆明種小鼠，體重1822 g，雌雄兼用。2  方法2.1  造模及給藥方法昆明種小鼠,雌雄各半,隨機分為5組，分別為:正常對照組、模型組、腦復(fù)康組(500 mg/k

10、g) 、熟地高劑量組(9 g/kg) 、熟地低劑量組(4.5 g/kg) ，每組20只動物。各給藥組給予相應(yīng)藥物, 正常組、模型組灌胃生理鹽水,灌胃體積均為0.2 ml/10 g體重,1次/d,至實驗結(jié)束。給藥同時,除正常對照組外,其余各組均灌胃AlCl3 4 mg/d,連續(xù)90 d。2.2  跳臺實驗依文獻(xiàn)5方法測定小鼠訓(xùn)練期錯誤反應(yīng)次數(shù)、測試期錯誤反應(yīng)次數(shù)和測試期觸電潛伏期。2.3  Morris水迷宮實驗依文獻(xiàn)6方法測定小鼠訓(xùn)練期尋找平臺潛伏期及測試期撤除平臺后跨越原平臺相應(yīng)位置次數(shù)。2.4  膽堿酯酶活性檢測跳臺實驗結(jié)束后，斷頭處死各組動物，迅速剝離大腦，

11、將大腦沿矢狀縫分成左右半球，取左側(cè)大腦在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，按膽堿酯酶測定試劑盒說明書測定膽堿酯酶活性。2.5  鋁離子(Al3 + ) 含量測定跳臺實驗結(jié)束后，斷頭處死各組動物，迅速剝離大腦，取右側(cè)大腦干燥，稱重，采用等離子體反射光譜法測定Al3 +含量。2.6  谷氨酸(Glu)、氨基丁酸(GABA)含量測定同前取小鼠左側(cè)大腦，按文獻(xiàn)方法7進(jìn)行。2.7  腦組織形態(tài)學(xué)觀察同前取小鼠右側(cè)大腦，按常規(guī)制作病理組織切片，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化，并攝取照片。3  統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用±表示,組間比較

12、進(jìn)行方差齊性檢驗及t 檢驗。2  結(jié)果2.1  對AlCl3 所致記憶障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響跳臺實驗表明，AlCl3所致記憶障礙模型組與正常對照組比較,小鼠訓(xùn)練期和測試期的錯誤反應(yīng)次數(shù)均明顯增多(P0.01) ,測試期觸電潛伏期明顯縮短(P0.01) 。熟地黃和腦復(fù)康組小鼠,訓(xùn)練期和測試期跳臺錯誤反應(yīng)次數(shù)均明顯減少(P0.01) ,測驗期觸電潛伏期明顯延長(P0.05) 。結(jié)果見表1。2.2  對AlCl3 所致記憶障礙小鼠空間記憶能力的影響在Morris水迷宮實驗中, 第1天,模型組小鼠尋找平臺時間(SPL)較正常對照組顯著延長(P0.05),隨著訓(xùn)練時間的

13、增加,模型組小鼠的SPL 逐漸縮短,但遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于對照組,二者之間差距也越來越大(P0.01)。熟地黃和腦復(fù)康組小鼠,在實驗開始時SPL 就較模型組有縮短的趨勢,至訓(xùn)練的第3天,腦復(fù)康組小鼠SPL較模型組顯著縮短(P0.05) 。隨著訓(xùn)練時間的增加,各給藥組SPL 縮短明顯,與模型組之間差異更明顯(P0.01)。撤除平臺后,模型組小鼠跨越原平臺位置次數(shù)較正常對照組明顯減少(P0.01)，熟地黃和腦復(fù)康組小鼠跨越原平臺位置次數(shù)較模型組小鼠明顯增加(P0.05)。結(jié)果見表2。表1  熟地對氯化鋁致記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（跳臺法）（略）與空白對照組比較，*P0.01；與模型組比較，#

14、P0.05,#P0.01；n=20表2  熟地對氯化鋁致記憶障礙模型小鼠尋找平臺潛伏期和跨臺次數(shù)的影響（略）與空白對照組比較，*P0.05,*P0.01；與模型組比較，#P0.05,#P0.01；n=20         2.3  對AlCl3 所致記憶障礙小鼠腦AchE 活性、Al3+ 的影響模型組小鼠腦組織中乙酰膽堿酯酶(AchE) 活性較正常組明顯升高(P0.01)，熟地黃和腦復(fù)康組小鼠,腦組織中AchE 活性顯著降低(P0.05，P0.01)。結(jié)果見表3。模型組小鼠腦組織中鋁離子(Al3

15、+ ) 含量較正常組明顯升高(P0.01)，給予熟地黃或腦復(fù)康后,小鼠腦組織中Al3 +含量明顯降低(P0.01)。結(jié)果見表3。表3  熟地對氯化鋁致記憶障礙模型小鼠腦組織中膽堿酯酶活性、鋁離子含量的影響（略）與空白對照組比較，*P0.01；與模型組比較，#P0.05,#P0.01；n=102.4  熟地對氯化鋁所致記憶障礙小鼠腦組織中Glu、GABA含量的影響見表4。表4  熟地對氯化鋁致記憶障礙模型小鼠腦組織中Glu、GABA含量的影響（略）與空白對照組比較，*P0.01；與模型組比較，#P0.05,#P0.01；n=10   以上結(jié)果表明

16、，模型組小鼠腦組織中Glu/GABA水平與正常對照組比較差異明顯（P0.01）；熟地高劑量組、熟地低劑量組、腦復(fù)康組Glu/GABA水平接近正常，與模型組比較差異顯著。2.5  組織形態(tài)學(xué)觀察正常對照組小鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞的胞漿豐富，核膜清楚，核仁明顯，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核仁清晰，胞漿透亮或淡染。見圖1。   模型組小鼠大腦主要病變位于腦皮質(zhì)、海馬等區(qū)域，水腫區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的胞漿和胞核界線不清，有些核圍縮小或呈三角形，核仁消失，著色深染，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)見有空泡。見圖2。神經(jīng)纖維軸索腫脹、斷裂或呈螺旋狀。見圖3。   熟地高劑量組、低劑量組

17、及腦復(fù)康組小鼠腦組織的病理形態(tài)較模型組有明顯改善，神經(jīng)細(xì)胞個別有輕度的固縮及深染，神經(jīng)纖維軸索輕度腫脹，表明其病變有所改善。見圖46。圖1  正常對照組 （略）      圖2  模型組（略）    圖3  模型組（略）        圖4  腦復(fù)康組（略）    圖5  熟地高劑量組（略）   &

18、#160;  圖6  熟地低劑量組（略）    3  討論   實驗結(jié)果表明,熟地黃具有改善AlCl3 所致記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶和空間記憶能力的作用,為熟地黃臨床用于智力障礙疾病的治療提供了實驗依據(jù)。中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)在學(xué)習(xí)記憶中具有十分重要的作用,被認(rèn)為是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)通路8。本實驗觀察到，熟地黃具有改善AlCl3 所致記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用,同時又能明顯抑制小鼠腦中AchE活性,說明熟地黃改善學(xué)習(xí)記憶作用與降低模型小鼠腦組織中AchE 活性,維持腦內(nèi)Ach 含量,改善

19、中樞膽堿能系統(tǒng)功能有密切關(guān)系。   研究表明,鋁的毒性作用可引起- 淀粉樣前體蛋白(- APP) 在腦內(nèi)神經(jīng)元的過度表達(dá),進(jìn)而繼發(fā)引起- 淀粉樣蛋白(- AP) 在腦內(nèi)神經(jīng)元的沉積,從而阻礙了神經(jīng)元之間的正常突觸活動,引起學(xué)習(xí)記憶能力的下降9。本實驗采取氯化鋁灌胃成功復(fù)制記憶障礙小鼠模型,給予熟地黃后,不僅改善了模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,又能顯著降低模型小鼠腦組織中鋁離子含量。病理形態(tài)學(xué)觀察也表明熟地黃對于記憶障礙小鼠腦組織具有保護(hù)作用。   中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)氨基酸遞質(zhì)可分為興奮性和抑制性兩類, Glu 屬于前者, GABA 屬于后者。一般認(rèn)為,Glu 對正

20、常動物或不同記憶障礙模型動物的學(xué)習(xí)記憶有改善作用10,但另一方面,腦內(nèi)Glu 及類似物水平過高可產(chǎn)生神經(jīng)毒性,對腦功能有不利影響11 。另有研究表明,動物在訓(xùn)練后,腦室內(nèi)注入GABA 可加強學(xué)習(xí)12功能。以上事實提示,腦內(nèi)Glu 和GABA 共同調(diào)節(jié)著學(xué)習(xí)記憶功能,二者水平的過高或過低都會影響學(xué)習(xí)記憶，只有二者維持在適當(dāng)水平才有利于學(xué)習(xí)記憶功能的正常發(fā)揮。本實驗結(jié)果提示給予AlCl3 所致記憶障礙模型小鼠熟地黃后，有利于其腦內(nèi)Glu和GABA含量維持在正常水平。   綜上所述，熟地黃具有改善氯化鋁所致記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶和空間記憶能力的作用，其機制可能與改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，調(diào)節(jié)Glu和GABA水平及保護(hù)腦組織，防止過量Al3 +對其的毒害有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 吳馥梅,蕭信生.學(xué)習(xí)記憶及其腦內(nèi)突觸機制J.自然雜志,1991,14(10):746.2 吳正治, 唐春艷, 盧漢平.天秦1號對老年癡呆模型的益智作用及機理探討J.中國醫(yī)藥學(xué)報, 1999, 14(2):98.3 陳可冀.跨世紀(jì)腦科學(xué)