重組白介素-2增強口蹄疫病毒多表位疫苗免疫效果研究.docx

1、A研究論文?重組白介素-2增強口蹄疫病毒多表位疫苗免疫效果研究蘇春霞】，段相國2,陳溥言3(1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學與免疫學系，寧夏銀川750004,2,寧夏醫(yī)科大學檢驗學院臨床免疫學檢驗系，寧夏銀川750004,3.南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，江蘇南京210095)摘要：通過研究重組白細胞介素-2(IL-2)對口蹄疫病毒(FMDV)多表位疫苗免疫效果的增強作用，為IL-2作為FMDV表位疫苗佐劑應用提供實驗依據(jù)。6周齡雌性Balb/c小鼠，分為4組，第1組聯(lián)合免疫表達豬IL-2的重組腺病毒(rAd5poIL-2)和串聯(lián)表達FMDV多表位基因的重組腺病毒(r

2、Ad5EGS),第2、3和4組分別注射rAd5EGS、滅活疫苗和PBS,間隔2周免疫1次，共免疫3次。首免后每周采血分離小鼠血清，通過ELISA檢測血清中特異性IgG；首免后6周檢測血清中抗體亞型IgGlJgG2a及fw胞因子IL-4和IFN-y的表達水平，同時分離脾細胞,MTT法檢測淋巴細胞增殖指數(shù)。結果顯示，聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS既能增強rAd5EGS誘導小鼠特異性IgGJgGl和IgG2a的分泌，又能增強其誘導淋巴細胞增殖能力，且免疫效果強于滅活疫苗，細胞因子檢測結果顯示，聯(lián)合免疫rAd5poIL-2后能增強rAd5EGS誘導小鼠IL-4和IFN-y的分泌，且其誘導

3、IL-4和IFN-y分泌能力也強于滅活疫苗。說明重組IL-2能有效增強FMDV多表位疫苗誘導抗體分泌能力和細胞免疫應答，rAd5poIL-2有望作為FMDV表位疫苗的候選佐劑。關疑詞：口珅疫病毒；多表位疫苗；佐制：白細胞介素-2中圖分類號：Q81文獻標識碼：A文章編號:1007-5038(2014)12-0001-04收稿日期：2014-03-04基金項目：國家自然科學蒸金項目(31001064,81260678,31360600),寧夏自然科學裹金項目(NZ13060)；寧夏教育廳高等學?？茖W研克項目(NGY2O12O65)作者簡介：蘇春霞(1977-),女，寧夏鹽池人，副教投，博士，主要從

4、亨分子病毒學與免疫學研究.口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的反芻動物的一種高度傳染性疾病,FMD在國際上被稱為“政治經(jīng)濟病"，主要是因為其傳播速度快，防控難度較大，而造成的經(jīng)濟損失巨大。目前，疫苗接種仍然是發(fā)展中國家控制FMD的一項重大策略UF,但傳統(tǒng)的FMD疫苗存在不能區(qū)分疫苗接種與自然感染以及潛在的生物安全隱患等問題，因此，F(xiàn)MD新型疫苗如亞單位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和重組病毒疫苗等被廣泛研究以往的研究表明，合成肽疫苗或重組蛋白疫苗能誘導中和抗體的產(chǎn)生并能有效保護病毒對實驗動物的攻擊,但這些疫苗的免疫原性不如傳統(tǒng)滅活

5、疫苗。因此，研究者試圖通過增加抗原表位的數(shù)量或加入T輔助細胞表位等方法增強新型疫苗的免疫原性心】。我們前期構建了串聯(lián)表達FM-DV多表位基因，同時引入通用型輔助性T淋巴細胞表位(parde)e?！?，但其誘導小鼠抗體水平和細胞免疫應答略低于滅活疫苗。很多研究者試圖利用細胞因子佐劑與FMD疫苗聯(lián)合免疫動物，以增強后者的免疫原性。本研究通過聯(lián)合免疫表達豬IL-2的重組腺病毒(rAd5poIL-2)和串聯(lián)表達FMDV多表位的重組腺病毒(rAd5EGS),觀察IL-2對FMDV多表位疫苗誘導小鼠免疫功能的影響，為IL-2作為FMDV表位疫苗的候選佐劑提供實驗數(shù)據(jù)。1材料與方法1.1材料表達豬IL-2的重

6、組腺病毒(rAd5poIL-2)、表達FMDV多表位重組腺病毒(rAd5EGS)、重組FMDVVP1蛋白由寧夏醫(yī)科大學病原生物學與免疫學系實驗室保存；O型FMD滅活疫苗為中牧股份蘭州生物藥廠產(chǎn)品；HRP標記的山羊抗小鼠抗體為CaltagLaboratories公司產(chǎn)品；細胞因子IL-4和IFN-y檢測試劑盒為Raybiotech公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。1.2方法1.2.1動物的分組與免疫接種6周齡雌性Balb/c小鼠分為4組，每組12只，第1組聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS,第2、3和4組分別注射rAd5EGS、滅活疫苗和PBS,免疫劑量均為1XUTCIDs。

7、/只，滅活疫苗和PBS組分別注射200pL,間隔2周免疫接種1次，共免疫接種3次。1.2.2脾淋巴細胞增殖試驗首次免疫接種后6周，參考文獻7采用MTT法檢測淋巴細胞增殖功能，簡述如下：無菌制備小鼠單個脾細胞懸液，接種到96孔板中，同時加入終濃度為10Mg/mL的重組VP1蛋白,37C培養(yǎng)44h,加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，每孔加100ptLDMSO,在微量:振蕩器振蕩，用酶標儀測570nm吸光度值。1.2.3 抗體和抗體亞型檢測分別于免疫接種后1周6周尾靜脈采血，分離血清，常規(guī)ELISA檢測小鼠血清中抗VP1特異性IgG水平,首免后6周，ELISA檢測血清中IgGl和IgG2a抗體亞

8、型水平。1.2.4 血清中IL-4和IFN-y的測定首次免疫接種后6周，定量ELISA檢測小鼠血清中IL-4和IFN-y的表達水平，操作按Raybiotech公司試劑盒說明書進行。1. 2.5統(tǒng)計學分析采用GraphpadPrism5軟件,數(shù)據(jù)表示為三士SD,方差分析或t檢驗.PV0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果1小鼠特異性淋巴細胞增殖水平首次免疫接種后6周，rAd5EGS能誘導小鼠淋巴細胞增殖，但其誘導淋巴細胞增殖能力略低于滅活疫苗»rAd5poIL-2和rAd5EGS聯(lián)合免疫后，誘導小鼠淋巴細胞增殖水平顯著高于單獨免疫rAd5EGS組（PV0.01）,而且聯(lián)合免疫組誘導小鼠淋巴

9、細胞增殖能力也明顯高于滅活疫苗組（PV0.05）t采用GraphpadPrism5中的t檢驗分析，結果見圖1。2.2特異性抗體和抗體亞型的檢測ELISA結果顯示，rAd5EGS能刺激抗FMDVVP1特異性IgG的分泌，但其分泌水平低于滅活疫苗；rAd5poIL-2和rAd5EGS聯(lián)合免疫后能明顯提高小鼠血清中抗VP1特異性IgG的分泌水平，與單獨免疫rAd5EGS組相比，差異極顯著（PV0.01）,而且聯(lián)合免疫組誘導小鼠抗體分泌水平略高于滅活疫苗組，采用GraphpadPrism5中的方差分析，結果見圖20IgG抗體亞型檢測結果表明，免疫接種后6周，rAd5EGS能刺激小鼠抗VP1特異性IgG

10、l和IgG2a的分泌，與滅活疫苗相比，其誘導小鼠IgG2a的分泌水平略高，與單獨免疫rAd5EGS相比.聯(lián)合免疫rAd5poIL-2與rAd5EGS后，能明顯提高血清中IgGl和IgG2a的分泌（PV0.05）,采用GraphpadPrism5中的方差分析，結果見圖3。聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS能明顯提高rAd5EGS誘導小映淋巴細胞增殖能力廣，*”PV0.01.與滅活疫苗組相比.差笄顯著.-”PV0.05,nsP>0.05CombinedimmunizationwithrAd5po!L-2andrAd5EGScouldenhancerAd5EGSinducingabi

11、lityoflymphocyteproliferationinmice；*«*"PV0.01,andsignificantlyhigherthaninactivatedvaccine,“«”PV0.05,nsP>0.05圖1小眼淋巴細胞增殖試驗g«Aao含0聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS能明顯提高rAd5EGS誘導特異性IgG的產(chǎn)生，"*”PV0.001,“*MP<0.01,nsP>0.05CombinedimmunizationwithrAd5polL-2andrAdoEGScouldenhancerAd5EG

12、SinducingabilityofspecificIgGsecretion.*"P<0.001,-*"P<0.01,nSP>0.05圖2抗FMDVVP1特異性抗體Ig(；檢測Fig.2Detectionofanii-FMDVVP1specificIgG2.3小鼠血清中IL-4和IFN-y的測定首免后6周，rAd5EGS能誘導IL-4和IFN”的產(chǎn)生，但誘導IL-4的分泌水平低于滅活疫苗,rAd5poIL-2與rAd5EGS聯(lián)合免疫小鼠后能明顯增強rAd5EGS誘導1L-4和IFN-y分泌的能力，差異極顯著(P<0.01)；聯(lián)合免疫組誘導小鼠IL-4

13、和IFN-y分泌的能力也高于滅活疫苗組，采用GraphpadPrism5中的方差分析，結果見圖4。Fig.1MouselymphocyteproliferationtestPBS聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS能明顯提高rAd5EGS誘導待性性IgGl和lgG2a抗體亞型的產(chǎn)生，“*”PV0.01,“*"PV0.05,nsP>0.05CombinedimmunizationwithrAd5poIL-2andrAd5EGScouldenhancerAd5EGSinducingabilityofspecificIgGlandIgG2asecretion,-*”PV0.0

14、1,“*”PVO.O5,n$P>O.O5圖3抗VP1特異性抗體IgG亞型檢測Fig.3DetectionofspecificVP)IgGsubtypes聯(lián)合免疫rAd5polL-2和rAd5EGS能明顯提高rAd5EGS誘導小鼠IL-4和IFN-y的分»»»"P<0.001,44«»nP<0.01,nsP>0.05CombinedimmunizationwithrAd5poIL-2andrAd5EGScouldenhancerAd5EGSinducingIL-4andIFN-ysecretion,u*"

15、;P<0.001."*”PV0.01,nsP>0.05圖4小Bl血清中IL-4和IFN-y的水平Fig.4ExpressionlevelofIL-4andIFN-yinmouseserum3討論近年來，F(xiàn)MD新型疫苗的研究發(fā)展很快，但就表位疫苗或重組蛋白疫苗而言，其免疫效果依然不如傳統(tǒng)的滅活疫苗，因此，研究者試圖通過增加抗原表位或引入合適的輔助性T細胞表位以增強疫苗的免疫原性。我們前期通過Linker將。型FMDV的5個B細胞表位和2個T細胞表位基因串聯(lián).同時引入PARDE,構建重組腺病毒(rAd5EGS),小鼠免疫試驗顯示rAd5EGS能誘導特異性抗體分泌與細胞免疫應答

16、，但其免疫原性略低于滅活疫苗3m。在FMD疫苗設計策略中，細胞因子如干擾素，IL-2、IL-6JL-15等常常被用于增強疫苗免疫效果-，其中IL-2是促進T細胞生長的主要細胞因子，能促進各種免疫效應細胞的分化，包括T、B淋巴細胞，因此，在疫苗研究中JL-2的應用最為廣泛m*】。機體抵抗FMDV感染過程中主要依賴于中和抗體發(fā)揮的體液免疫應答，但細胞免疫應答對清除病毒也是必不可少的。我們前期研究結果顯示，rAd5EGS免疫小鼠后誘導細胞免疫應答能力高于重組VP1疫苗，可見增加表位數(shù)量能明顯增強細胞免疫應答.但是rAd5EGS誘導小鼠特異性抗體產(chǎn)生的能力仍低于滅活疫苗】。本研究結果顯示，聯(lián)合免疫rA

17、d5poIL-2和rAd5EGS后不但能提高疫苗誘導的抗體分泌水平，而且可以增強疫苗誘導的淋巴細胞增殖能力，且免疫效果強于滅活疫苗。在小鼠體內(nèi)，Thl型細胞會介導B細胞產(chǎn)生IgG2a型抗體，Th2型細胞則會介導B細胞產(chǎn)生IgGl型抗體。本研究中，rAd5EGS免疫小鼠后既能誘導IgGl的分泌，又能誘導IgG2a的分泌，與滅活疫苗相比，有促進IgG2a分泌的優(yōu)勢，即促進Thl免疫應答；而聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS后能同時提高IgGl和IgG2a的分泌水平，與滅活疫苗組相比，聯(lián)合免疫組能明顯增強lgG2a的分泌水平，誘導IgGl的分泌水平略低于滅活疫苗組，但差異不顯著(P>

18、0.05).IFN-yJL-4分別是Thl和Th2細胞的特征性細胞因子。IL-4在體液免疫應答中發(fā)揮重要作用；IFN-y在抗病毒感染方面起著非常重要的作用，IFN-y水平是衡量FMD疫苗能否預防亞臨床感染的重要指標。本研究中，rAd5EGS免疫小鼠后既能誘導IFN-y的分泌又能誘導IL-4的分泌，但其誘導IL-4的能力低于滅活疫苗，而聯(lián)合免疫組能同時提高IFN-y和IL-4的分泌水平，且誘導細胞因子分泌的能力高于滅活疫苗。在小鼠體內(nèi)，Thl細胞亞群主要介導細胞免疫應答，Th2細胞亞群介導體液免疫應答，本研究結果顯示rAd5EGS免疫小鼠后能明顯提高Thl免疫應答，即促進細胞免疫應答。聯(lián)合免疫r

19、Ad5poIL-2和rAd5EGS后能同時增強Thl和Th2免疫應答，有效地調節(jié)了Thl和Th2的平衡，既促進了細胞免疫應答，又促進了體液免疫應答，為重組IL-2作為FMD重組疫苗佐劑的臨床研究奠定了基礎。參考文獻：1 施程洪，朱明旺，王繼華.等.口蹄疫滅活疫苗免疫增強劑的可行性應用分析J.中國81防獸醫(yī)學報.2014(1):58-62.2 JamalSM,BelshamGJ.Foot-and-mouthdisease：past,presentandfutureCJ,VetRes.2013：44：116.3 ParkJH.Requirementsforimprovedvaccinesagain

20、stfoot-and-mouthdiseaseepidemicsJ.ClinExpVacRes,2013,2(D.8-18.41李婷婷，王君偉.口踏疫合成肽疫苗研究進展JI.動物醫(yī)學進展,2012,33(4):76-79.5 SuCX.DuanXG,LiangLJ,ctal.LyciumbarbarumpolysaccharidesasanadjuvantforrecombinantvaccinethroughenhancementofhumoralimmunitybyactivatingTfhcellsJ.VetImmunollmmunopathol.2014,158(1-2).98-104

21、.6 CaoY,LuZ.LiD*etal.Evaluationofcross-protectiona-gainstthreetopotypesofserotypeOfoot-and-mouthdiseasevirusinpigsvaccinatedwithmulti-epitopeproteinvaccineincorporatedwithpoly(I：C)J.VetMicrobioL2014,168(2-4)：294-301.7 SuC.DuanX,WangX.etal.HeterologousexpressionofFMDVimmunodominantepitopesandHSP70inP

22、.pastarisandthesubsequentimmuneresponseinmiceJ.VetMicrobiol,2007,124,256-263.8 ShaoJJ.WangJF,ChangHY.etal.Immunepotentialofanovelmultiple-epitopevaccinetoFMDVtypeAsia1inguineapigsandsheepCJ.VirolSinica,2011,26(3)1190-197.9 王鋒.段相國.趙瑞，等.申聯(lián)表達FMDV多表位基因重組腺病毒免疫小鼠的效應研究J.寧夏醫(yī)科大學學報,2012.34(10) ,989-992.10 蘇春U

23、.段相國,張惟麗.等.表達口蹄疫病毒多表位基因更組腺病毒的構建J.寧夏毆學雜志,2009.31(12)：1111-1112.11 KimSM,KimSK,ParkJH.etal.Arecombinantadenovirusbicistronicallyexpressingporcineinterferon-aandinterferon-yenhancesantiviraleffectsagainstfoot-and-mouthdiseasevirus。.AntiviralRes,2014.104：52-58.12 SuC»DuanX.ZhengJ.etal.IFN-aasanadju

24、vantforade-novirus-vectoredFMDVsubunitvaccinethroughimprovingthegenerationofTfollicularhelperPLoSOne.20138(6)：e6134.13 蘇春藏.段相國，鄭清.等.共表達FMDVVP1-2A基因與豬IL-2承組腺病毒的構建及其免疫原性研究J.動物厭學進展,2014,35(2):1-5.14 蘇春霰，段相國.臼瑙兵，等.重組猜IL-2對口蹄疫娘組腺病毒免疫增強效果的研究J.免疫學雜志.2014,30(2):110-113.EnhancementofImmuneEffectofFoot-and-Mo

25、uthDiseaseMulti-epitopeVaccinebyRecombinantIL-2SUChun-xia1,DUANXiang-guo2,CHENPu-yan3(1.SchoolofBasicMedicalSciencesNingxiaMedicalUniversity.Yinchuan«Ningxia7500049China；2.laboratoryExaminationcollegeNingxiaMedicalUniversity9YinchuanfNtngxia750004China;3KeyLaboratoryofAnimalDiseasesDiagnosis&am

26、p;ImmunologyofChinaSDepartmentofAgricultureNanjingAgriculturalUniversity.Nanjing.Jiangsu.210095China)Abstract:Toinvestigatetherecombinantinterleukin-2(IL-2)enhancingtheimmuneeffectoffoot-and-mousedisease(FMD)multi-epitopevaccineinmice»toprovidetheexperimentalevidenceforstudyingapplicationofIL-2

27、asanadjuvantforFMDepitopevaccine,6weeksoldfemaleBalb/cmiceweredividedinto4groups,miceofgroup1werecombinedimmunizedwithrecombinantadenovirusexpressingporcineIL-2(rAd5poIL-2)andrecombinantadenovirusexpressingFMDVmulti-epitopes(rAd5EGS).miceofgroup2,3and4wereinjectedwithrAd5EGS,inactivatedvaccineandPBSrespectively»injectiononceeverytwoweekintervalsfor3times.TheserafrommicewerecollectedeveryweekafterimmunizationandthespecificIgGwasdetectedbyELISA；thesecretionlevelsofIg