鈣離子對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定的影響.docx

1、鈣離子對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定的影響魏振洲仃杜送田宙石超府王啟珍k曹鑫祥馬明霞蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗一室甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心W甘肅蘭州730046摘要：目的研究Ca”對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)的影響A探討其影響機(jī)制N方法向已知含量的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液中加入不同濃度的Ca"。用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)各樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量H對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行離散系數(shù)#即CV值分析確定干擾限值！對(duì)加入不同濃度C的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行核磁共振'H譜研究J結(jié)果當(dāng)C廣濃度高于0J020molL時(shí)i檢測(cè)結(jié)果的CV值較高j3+濃度越高"V值越高離散程度越大J當(dāng)C濃度達(dá)到1mo.L時(shí)i檢測(cè)結(jié)果低于檢測(cè)限*呈現(xiàn)明顯

2、的假陰性F1H譜研究發(fā)現(xiàn)F隨著Ca"濃度的增高R處于低場(chǎng)的氫的化學(xué)位移向高場(chǎng)移動(dòng)ilCa"濃度越高;移動(dòng)越大；結(jié)論為獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果I當(dāng)CF濃度高于0.0020molL時(shí)f應(yīng)先消除干擾f再測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素含量KCa2+可能通過(guò)影響細(xì)菌內(nèi)毒素的空間構(gòu)象來(lái)影響其與堂試劑的反應(yīng)If關(guān)鍵詞:細(xì)菌內(nèi)毒素P蜜試劑檢測(cè)法/動(dòng)態(tài)濁度法J鈣離子1核磁共振i譜中圖分類號(hào)：R927文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：】0。55673(?(119)06-0(14廠05DOI:10.m09/ki.pmi.2019.06.007Effectofcalciumionindeterminationofbacteria

3、lendotoxinWEIZhen-ihou(DUSon'tiiniSHIChao(WaNGQiLheniCAOXiniMAMingiiaTheFirstBacterialVaccineDivisionlheD:agnosticSuppliesDiviiionfLanzhouInstituteofBiologi(alProductsCo.iLtd.iCenterforGan$uProvincialVaccineEngineeringResearchLanzhou7300461GansuProvince-ChinaCorrespondingauthor：MAM:ng-x:a-E_mail

4、：mamxl2Abstract:ObjectiveToanalyzetheeffectiromCa"indetectionolbacterialendomincontentandIoinvesligitelherelatedinllueDcialmechiDism.MethodsDifferentconcenlralionsofCt!*wereaddedIosknownconcentralioDolbacierialendotoxinsolutioniandthenlhebtcierialendotoxincontenlwndeterminedineachsampleaccordin

5、gtothedynamicturbidimelryiandanalysisofadiscretecoefficient(CV)wasperformedindeterminingoftheinterferencelimit.Thebacleriilendotoxinindbacleriilendoloxinsampleswithdifferen:concentrationsofCa:*werecarriedouibyusingolNMR1Hspectrumfsoastomakecerltinthepossibleinlluenciilmechanism.ResultsWhenlheCr+conc

6、entrilionwashigherthan0.0020mol/LfappearedaCi!4coneenlrationdependentpitlern(lheCVvalueiromlhetedresultwasincreased!wilbigreaierdegreeofdispersion.WhenlheCa?"concenlralionreached1mol/lhedelect:onresultwaslowerthmthede:eclionlimilfshowing8signilicantfalsenegative.ItwasfoundbjNMRHspectrumfastheco

7、ncentrrionofCb3+increased!thechemical$hiltfromhydrogenin:helowfieldmovedtowardthehighfield3ni3greatermovemenl&longw:ihahighCi:+coDcenlralioD.ConclusionInordertooblainlheaccuratedelectionreiultsiwhentheCrTconcenlritionwashigherIhm0.0020molILilheinterferenceshouldbeeliminatedfirstiand:henthebacter

8、ialendotoxinconlenlcouldbecorrectlydeiermined.TheCa1*mayinierferew:lh'ntersclionbetweenbacterialendotoxinandLAL(limulusamoebocyielyute)bymeansofaflecling:he$palia)con:o:malionofbacteria,endotoiin.Keywords:BacierialendotoiinlLimulusamoebocylelysate(LAL)teillDynamicturbidimetrymethod!CiltiumionjNM

9、R!Hspectrum細(xì)菌內(nèi)毒素(endoioxin)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的特有結(jié)構(gòu)'能導(dǎo)致人體發(fā)熱、休克甚至死亡'勺作者簡(jiǎn)介：魏振洲(1打Di男i醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師主要從事細(xì)菌性疫苗的檢定工作H通信作者：馬明馥#醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師iE_mB：l:mjmrl2其化學(xué)成分主要是由特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成成類脂A是內(nèi)毒素多種生物活性或毒性反應(yīng)的主要基團(tuán)3M大腸桿菌主要基團(tuán)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖14I細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法主要包括：家兔檢測(cè)法、圖1大腸桿菌脂質(zhì)A的化學(xué)結(jié)構(gòu)4Fig.lThechemicalstructureoflipidAfromEscherichiacoliGC/MS檢測(cè)法

10、及鯊試劑檢測(cè)法等富內(nèi)毒素能與蜜試劑發(fā)生特異性的反應(yīng)而被檢測(cè)K分為凝膠法、濁度法和比色法#'對(duì)于曾血變形細(xì)胞裂解液凝集反應(yīng)機(jī)制的研究直到20世紀(jì)70年代后期G才由日本學(xué)者闡明N堂血變形細(xì)胞裂解液中有許多能被內(nèi)毒素激活的凝固系統(tǒng)R主要有凝固酶原、C因子、B因子及凝固蛋白原等計(jì)內(nèi)毒素激活C因子*活化的C因子又激活B因子i或由（3）TD一葡聚糖激活G因子（G因子系統(tǒng)）«接著激活的B因子或激活的G因子。再去激活凝固酶原使其轉(zhuǎn)化為活化的凝固酶原W該酶切斷凝固蛋白原中特定的精氨酸肽鏈府形成凝固蛋白S產(chǎn)生凝膠仲除此之外就凝固酶還對(duì)蜜三肽有酰氨酶活性N使硝基苯胺游離&而發(fā)生成色反應(yīng)5f

11、近年來(lái)府很多科研工作者研究了蜜試劑檢測(cè)法的干擾因素58R本文探究了鈣離子對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)的干擾*現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下甘1材料與方法1.1樣品含不同濃度Ca2+的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（批號(hào)20190501'20190511）i由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗一室提供用1.2主要試劑及儀器蜜試劑（檢測(cè)范圍0.03、10.00EU/mL）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量<0.003EU/mL）均購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司i細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)食品藥品檢低研允院提供9氯化鈣購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司0二甲基亞礪1（Dimethyllulfoxide）購(gòu)自Alia公司IBET7

12、2M細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀購(gòu)自天津天大天發(fā)儀器設(shè)備有限公司jVORTEX_GENE2漩渦混合器購(gòu)自美國(guó)SI公司jBruker（300MH?）核磁共振儀購(gòu)自美國(guó)Bruker公司H'1.3細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)1.3.1待測(cè)樣品的制備向己知含量的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入不同濃度的Ca2+以驗(yàn)證Ca2+對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)的影響J稱取適量CaCh于玻璃瓶中R250°C干烤1h干燥器中放至室溫月細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解CaClJ并依次梯度稀釋:'得到濃度分別為2.0000.1.0000>0.5000.0.2500.0.125 0.0.0625.0.0313.0.0156.0.0078

13、.0.00390.0020mol/L的CaCl,溶液j將效價(jià)為8。EU支的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)稀釋K得細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.5000EU/mL的溶液J最后1分別取濃度為2.0000.1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078、0.0039.0.0020mol/L的Ca"溶液0.5mL于試管中if向各管中加入0.5mL濃度均為0.5000EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液Ca2+濃度分別為1.00。0、0.5000、0.250D、0.1250、0.D625、D.D313、0.Q156.0.0078.0.0039、0J020,0.0

14、01Dmol/Lf細(xì)菌內(nèi)毒素濃度均為0.2500EU/mL的樣品H3.2動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備#在超凈工作臺(tái)下,取效價(jià)為80EU/支的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品1支彳用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解i渦旋混合器混勻15mini稀釋0.5000.0.2500.0.1250.0.0625.0.0313EU/mL5個(gè)濃度月取3支蜜試劑分別加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水靜宣充分溶解后混合待用月取內(nèi)毒素測(cè)定儀專用試管14支ft分別加入0.1mL鯊:試劑®每個(gè)點(diǎn)取2個(gè)平行管H其中1管加入內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照有4管加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照3"14管加入稀釋成0.500。

15、、0.250。、0.125R0.025、0.0313EU/mL5個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品W樣品細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)是將樣品稀釋成無(wú)干擾的濃度N立即放入反應(yīng)器中開(kāi)始檢測(cè)甘待最后一個(gè)濃度點(diǎn)的反應(yīng)曲線超過(guò)限值后彳停止檢測(cè)W計(jì)算數(shù)據(jù)彳得出樣品細(xì)菌內(nèi)毒素含量S1.4核磁共振法測(cè)定鈣離子對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)的影響1.4.1NMR樣品的準(zhǔn)備將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解在DMSOi分別加入CaCIJ使得Ca-濃度分別約等于細(xì)菌內(nèi)毒素麻準(zhǔn)品濃度的0.0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0割1.4.2譜的測(cè)定由核磁共振儀來(lái)完成細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的譜R通過(guò)含不同濃度Ca2+的樣品1H譜變化來(lái)推測(cè)Ca2f對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)的影

16、響機(jī)理N】H譜數(shù)據(jù)表示如下:化學(xué)位移R積分彳多樣性(br為寬峰Rs為單峰Rd為雙峰ilt為三重峰。q為四重峰im為多重峰)j耦合常數(shù)以HeJ0z(HO表示j1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用IBMSPSSSlatisiics22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析R計(jì)算出含不同濃度Ca2+的樣品的檢測(cè)結(jié)果的離散系數(shù)R即CV值孑CV值等于標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之比彳CV值越大則離散程度越大«CV值越小則離散程度越?。寒?dāng)CV值<10%時(shí)認(rèn)為離散程度較小i檢測(cè)結(jié)果受干擾因素影響較小R結(jié)果可接受*2結(jié)果2.1動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量結(jié)果顯示BCa"的加入對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的檢測(cè)有影響蜀Ca2+的濃度越高，

17、影響越大1當(dāng)C產(chǎn)濃度為1molL時(shí)f樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素低于檢測(cè)限K見(jiàn)表1S對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行CV值分析#當(dāng)Ca2+濃度高于0.0020mo：L時(shí)檢測(cè)結(jié)果CV值較高iCa"濃度越高CV值越高R離散程度越大H見(jiàn)表2K表1加入Ca2+的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液的檢刪結(jié)果Tab.lDelerm.nitionofbtclerialendoloxinsolutionsaddedwi:hCa:*樣品批號(hào)樣品中Cai及細(xì)菌內(nèi)毒素理論含量CL濃度(mol/L)內(nèi)毒素濃度(EUmL)實(shí)測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素(EU/mL)201905011.000201905020.500201905030.250201905040.125201

18、905050.062201905060.031201905070.015201905080.007201905090.003201905100.002201905110.0010.25000.25000.25000.25000.25000.25000.25000.25000.25000.25000.2500檢測(cè)限0.01300.03260.04970.06110.09680.11420.14680.18330.22360.2663表2細(xì)菌內(nèi)毒素含量的CV值Tab.2Coefficientofvariation(CV)forbacteridendotoxincon:en:Cam理論濃度(mol,

19、L)實(shí)測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素(EU/mL)1.0000檢測(cè)限0.50000.01300J1300.25000.03260.03260.0326'0.12500.04970.04970.04970.0497一0.06250.06110.06110.06110.06110.0611_0.03130.09680.09680.09680.09680.09680.09680.01560.11420.11420.11420.11420.11420.11420.1142一0.00780.14680.14680.14680.14680.14680.14680.14680.1468'0.00390.183

20、30.18330.18330.18330.18330.18330.18330.18330.18330.00200.22360.22360.22360.22360.22360.22360.22360.22360,22360.22360.00100.26630.26630.26630.26630.26630.26630.26630.26630.26630.26631CV(%)/68.70。059.82。052.11DD44.810036.350030.30。022.870。15."。D$.7400注：-無(wú)此項(xiàng)j/.未計(jì)算41. 2核磁共振法測(cè)定鈣離子對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)的影響細(xì)菌內(nèi)莓素樣

21、品進(jìn)行'555進(jìn)伸忻5伽MHiDMSO)It.iT(HJ=t.SBti1H<6.33<Hj=itHH1皿5.41(s<2H)li4.98(dBJ=4.7Hz#1H)B4.89(s1H)i4.78(sit2H)i|4.32(tilJ=7.1Hzt1H)t4.18(si2H)it3.71(mi3H)i|3.62($<5H)if3.5廣3.41(m(16H)i3,33(mi'55H)i3.17(m(1H)if2.95(mH1H)K見(jiàn)圖2H隨著Ca2+濃度的增高R處于低場(chǎng)的氫的化學(xué)位移向高場(chǎng)移動(dòng)SCa2+濃度越高N移動(dòng)越大開(kāi)除了化學(xué)位移有所變動(dòng)/氫的信號(hào)強(qiáng)度基本

22、相似W見(jiàn)圖3用因此«Ca2+的存在可能會(huì)影響細(xì)菌內(nèi)毒素的空間構(gòu)象Wooz.f8*£0二S9-寸98好90空寸-or寸芯打6*RS寸新S寸009寸6一9寸6號(hào)寸W.寸£.寸UV46Z096Hppm5.55.()4*54.03.53*02*52.01.5LO().5目照麗咽wm注:每個(gè)峰表示的是被檢測(cè)物品的氫的化學(xué)位移j積分面積表示氫的個(gè)數(shù)Pppm是化學(xué)位移的單位,圖2細(xì)菌內(nèi)毒素的z琳Fig.2AnilysisofbacterialendoloxinbyNMR'IIspectrum注：H譜廣6的Cl-濃度分別為細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的日、0.5,1.0,2.0,

23、3.0.-1.0倍量jppm是化學(xué)位移的單位f圖3加入不同濃度Ca2+的細(xì)萌內(nèi)毒素的ifFig.3AnalyjisofbacteridendotoxinsddedwithdilferentconcentrationsoiCr*byNMRHspeciium3討論細(xì)菌內(nèi)毒素蜜試劑檢查法由于檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、結(jié)果準(zhǔn)確、應(yīng)用面廣R從而被多個(gè)國(guó)家收錄于藥典中N研究表明麻試驗(yàn)環(huán)境、樣品純度等均有可能造成不準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果#為驗(yàn)證Ca"對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)的影響n向濃度為0.2500EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液中加入不同濃度的Ca2+再用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)各樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量i結(jié)果顯示i當(dāng)C姑濃

24、度高于0.0020mol/L時(shí)i檢測(cè)結(jié)果的CV值較高nCa2+濃度越高nCV值越高N離散程度越大j當(dāng)C廣濃度高于1mWL時(shí)1檢測(cè)結(jié)果低于檢測(cè)限呈現(xiàn)明顯的假陰性用對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素以及加入不同濃度Ca2+的細(xì)菌內(nèi)毒素，容液進(jìn)彳亍'11諼"究發(fā)現(xiàn)'Mi«c/.濃度的增高處場(chǎng)的級(jí)的化向尚場(chǎng)秒動(dòng)fC濃度越部移動(dòng)越大，而翅的信*J魅度和枳分面枳均未發(fā)現(xiàn)明顯改如因此？Ca'-可能是通過(guò)彩乾細(xì)苗內(nèi)猝素的空間構(gòu)象來(lái)影響其與盆試劑的反應(yīng)N空向構(gòu)段百變的緬南內(nèi)毒素不陲激活C因子，未活化的C因了無(wú)法激活B因子？m冏舶脫無(wú)法被激活，從而無(wú)法切斷故團(tuán)步白晚中將定的福敏酸肽做#不fi

25、S形成凝固安門(mén)及產(chǎn)生凝段&細(xì)誦內(nèi)寄紊的檢刈出現(xiàn)假明性站果$Ca"濃度越高£tfl萌內(nèi)咨素的空間構(gòu)象改變建大。越不易與貧試劑發(fā)生反應(yīng)，見(jiàn)圖if雙鏈C因子細(xì)菌內(nèi)存素活化的C因子單鏈C因子線路I精氨酸肽鏈凝固蛋白圖4Fig.2TheB因子活化的B因子活化的凝固酶原凝固福原活化的G因子G因子線路2(1-3)QD-葡聚糖細(xì)菌內(nèi)毒素與鯊試劑反應(yīng)機(jī)制5mechaniimonreactionof1)scierialendotoxinandLALreagent綜上所述N鯊試劑檢測(cè)法對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)K測(cè)定結(jié)果會(huì)受一定濃度的Ca2+干擾甘當(dāng)Ca”濃度高于1mol/L時(shí)d檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性iCa2+濃度越高舊干擾程度越大#通過(guò)核磁共振"譴奴iC/可能地通過(guò)影響細(xì)苗內(nèi)毒素的空向構(gòu)紋來(lái)影響其與fit試劑的反應(yīng)f從而影響檢測(cè)姑果的準(zhǔn)確性因此：夜用at試劑法進(jìn)行細(xì)曲內(nèi)洋紊含斌測(cè)定時(shí)？應(yīng)先酒除c，''的干擾1參考文獻(xiàn)1 許劍平i何曉凡熊石龍i等.血小板對(duì)單核細(xì)胞促凝活性的影響.中華血液學(xué)雜志i2001(22(9):478_479.2 HAR