聰液對癡呆大鼠模型腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)的影響

1、聰液對癡呆大鼠模型腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)的影響【摘要】 目的 探討呆聰液對癡呆大鼠模型腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)基因表達(dá)的影響。方法 22月齡SD大鼠采用海人酸破壞腦基底核法造成學(xué)習(xí)和記憶功能障礙的癡呆動物模型。造模后的大鼠隨機(jī)分為癡呆模型組、呆聰液(低、中、高劑量)組，同時設(shè)正常對照組，每組10只。呆聰液低、中、高劑量組每日呆聰液灌胃(低5 g/kg、中10 g/kg、高20 g/kg)，癡呆模型組和正常對照組每天用生理鹽水(10 ml/kg)灌胃，共1個月。通過水迷宮法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)觀察呆聰液對癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦內(nèi)APP基因表達(dá)的影響。結(jié)果 老齡癡呆模型大鼠

2、學(xué)習(xí)記憶能力下降，腦內(nèi)APP基因表達(dá)增強(qiáng)。呆聰液高、中、低劑量組能明顯提高學(xué)習(xí)記憶能力，降低腦內(nèi)APP mRNA含量，并有一定的量效關(guān)系，與癡呆模型組比較差異有顯著性(P【關(guān)鍵詞】  呆聰液;海人酸;動物癡呆模型;淀粉樣前體蛋白;基因表達(dá)研究表明，老年癡呆患者都有腦底動脈硬化、海馬區(qū)額葉老年斑及神經(jīng)元纖維纏結(jié)的病理變化。中樞meynert基底核神經(jīng)元缺失伴膽堿能神經(jīng)元功能障礙，海馬區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性降低，可出現(xiàn)不同程度的腦萎縮。因此，中樞膽堿能神經(jīng)功能障礙與癡呆程度密切相關(guān)。為進(jìn)一步闡明呆聰液治療老年癡呆的作用機(jī)制，本文在研究呆聰液對老齡鼠癡呆模型腦M受體及免疫功能影響的基礎(chǔ)上1，

3、探討呆聰液對老齡鼠癡呆模型腦M受體基因及β淀粉樣蛋白(Aβ)受體基因表達(dá)的影響。1 材料與方法1.1 動物 選用22月齡SD大鼠50只，體重250300 g，雌雄兼用，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物試驗中心提供。1.2 方法淀粉樣前體蛋白(βAPP) mRNA，βactin APP上游引物：(5′3′)AATCCTGCAGTACTGCCAAG,下游引物：(5′3′)TGGCAACAGTACTGCCAAG;βactin上游引物：(5′3′)CAACTTTACCTTGGCCACTACC，

4、下游引物：(5′3′)TACGACTGCAAACACTCTACACC，產(chǎn)物150 bp。RTPCRAPP的PCR循環(huán)條件：94變性30 s，62退火30 s，72延伸1 min;βactin的PCR循環(huán)條件為94變性30 s，55 退火30 s，72延伸1 min，完成35個循環(huán)后，取PCR產(chǎn)物8 μl在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，5 V，45 min，用自動成像儀(美國FOTODYNE公司)觀察拍照。重復(fù)實驗的電泳圖譜用STORM 860熒光掃描分析儀(美國DYNAMIC公司)分析，相對表達(dá)量根據(jù)各電泳區(qū)帶與內(nèi)對照βactin的面積之比來計算

5、。以βactin為內(nèi)參照，按公式βAPP/βactin計算βAPP mRNA水平。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理。2 結(jié) 果癡呆模型組βAPP mRNA的表達(dá)量(1.551±0.054)較對照組(1.483±0.005)明顯升高(P0.05)，呆聰液低、中、高各劑量組βAPP mRNA表達(dá)量分別為1.476±0.007、1.380±0.005、1.382±0.004，與癡呆模型組比較明顯降低(P0.05)。RTP

6、CR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果顯示呆聰液中劑量組效果最佳(圖1)。1.Marker 2.空白對照組 3.癡呆模型組 4.低劑量中藥組 5.中劑量中藥組 6.高劑量中藥組圖1 RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖3 討 論老年癡呆是一種記憶能力減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常為特征的腦退行性疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境和基因突變導(dǎo)致APP代謝異常，在神經(jīng)元細(xì)胞外產(chǎn)生Aβ沉積，并造成神經(jīng)元損傷2。Lin等3研究發(fā)現(xiàn)，大腦皮層膽堿能系統(tǒng)功能的完整性對保持正常的APP 水平和調(diào)節(jié)APP代謝有重要意義。APP 水平的升高與膽堿能活性下降有關(guān)，對那些大腦膽堿能系統(tǒng)核基質(zhì)受損的大鼠用N甲基D天門冬氨酸鹽處理，能提高

7、APP的mRNA水平和合成APP的能力。許多研究還證實，老年癡呆與神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)，Aβ可以增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生4,ROS又反過來促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，引起蛋白質(zhì)和DNA的功能改變，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡5。為了進(jìn)一步研究老年癡呆病的發(fā)病機(jī)制及臨床中藥混合制劑呆聰液的作用機(jī)制，本研究利用海人酸制備老齡大鼠癡呆模型進(jìn)行了中藥呆聰液對癡呆大鼠模型腦內(nèi)βAPP基因表達(dá)影響的探討，結(jié)果顯示癡呆模型組能明顯提高腦內(nèi)βAPP基因表達(dá)水平，使學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。中藥呆聰液能顯著改善老齡大鼠的記憶力和學(xué)習(xí)功

8、能。呆聰液的三個不同劑量組雖然都能抑制腦內(nèi)βAPP基因表達(dá)水平，但是中劑量組效果最佳。在改善學(xué)習(xí)記憶能力的同時，抑制了βAPP基因的轉(zhuǎn)錄，降低了βAPP mRNA的含量，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。【參考文獻(xiàn)】  1 岳啟安，趙淑梅，高敬宗，等.呆聰液對老齡大鼠癡呆模型腦M受體作用的實驗研究J.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000;20(11)：8468.2 劉建輝.早老性癡呆病淀粉樣蛋白A研究進(jìn)展J.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2003;20(2)：3714.3 Lin L,Georgievska A,Mattson A,et al.Cognitive changes a

9、nd modified processing of amyloid precursor protein in the cortical and hippocampal system after cholinergic synapse loss and muscarinic receptor activationJ.Proc Natl Acad Sci USA,1999;96(21):12108.4 Butterfield DA,Martin L,Carney JM,et al.Amyloid peptide displays H2O2like reactivity towards aqueous Fe2+,nitroxide spin probes and synaptosomal membrane proteinsJ.Life Sci,1996;58:217.5 Beckman JS,Chen