血管性癡呆大鼠腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化及生長(zhǎng)抑素和nNOS的表達(dá)(一)

1、血管性癡呆大鼠腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化及生長(zhǎng)抑素和nNOS的表達(dá)(一)    作者：宋志宇 盧宏 孫玉華 魏建科 譚巖 方艷秋【摘要】 目的 研究血管性癡呆(VD)大鼠生長(zhǎng)抑素(SS)、一氧化氮合酶(nNOS)的變化，探討兩者與認(rèn)知功能的關(guān)系。方法 將30只1415 w齡大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SOG)和模型組(MDG)，MDG組采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈絲線結(jié)扎方法，制備慢性前腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停琒OG組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不阻斷血流。應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，應(yīng)用透射電鏡觀察大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)海馬及顳葉皮層SS及nNOS的表達(dá)情況。

2、結(jié)果 水迷宮實(shí)驗(yàn)中MDG組大鼠的逃避潛伏期(69.70±4.77)s較SOG組(12.93±2.77)s明顯延長(zhǎng)(P0.05)，MDG組大鼠的跨平臺(tái)次數(shù)(1.80±1.31)較SOG組(8.33±1.30)明顯減少(P0.05)。透射電鏡觀察，海馬神經(jīng)元高度水腫，核固縮或崩解，線粒體腫脹。免疫組化結(jié)果表明，海馬區(qū)SS的表達(dá)MDG組(3.07±1.44)較SOG組(13.73±1.87)明顯下降(P0.05)，顳葉皮層區(qū)SS的表達(dá)MDG組大鼠(2.73±0.96)較SOG組(12.93±1.67)明顯下降(P0.05

3、);海馬區(qū)nNOS的表達(dá)MDG組大鼠(29.60±2.03)較SOG組(9.33±1.63)明顯增加(P0.05)，顳葉皮層區(qū)nNOS的表達(dá)MDG組大鼠(28.87±2.47)較SOG組(8.40±1.64)明顯增加(P0.05)。結(jié)論 VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化明顯，腦內(nèi)SS表達(dá)水平下降、nNOS表達(dá)水平增高。 【關(guān)鍵詞】 血管性癡呆;水迷宮實(shí)驗(yàn);透射電鏡;生長(zhǎng)抑素;一氧化氮合酶【Abstract】 Objective To study the changes of the somatostatin (SS), nitric oxide

4、 synthase (nNOS) of thevascular dementia (VD) rats, and to explore the relationship between them and the cognitive function. Methods 30 1415monthold rats were randomly divided into sham operation (SOG) and model groups (MDG), MDG group was ligated bilateral carotid artery by thread to prepare for th

5、e animal model of the chronic front cerebral ischemia. SOG group was only separated bilateral main carotid artery, but was not blocked the blood flow. Water maze test was used to test the abilities of spatial learning and memory of the rats. The transmission electron microscope was used to observe u

6、ltrastructural changes in rat neurons; immunohistochemical method was adopted to detect the SS and nNOS expressions in hippocampus and temporal cortex. Results In the water maze test, the escape latency of the MDG rats (69.70±4.77)s was significantly longer than that of SOG group (12.93±2.

7、77)s, P0.05，the number of crossplatform of MDG rats (1.80±1.31) was decreased significantly compared with that in SOG group (8.33±1.30), P0.05. TEM observation showed that there was high degree of edema in hippocampal neurons, karyopyknosis or collapse, and mitochondrial swelling. Immunohi

8、stochemistry results showed that the expression of SS in hippocampus was decreased significantly in MDG group(3.07±1.44)compared with that in SOG group (13.73±1.87), P0.05, the expression of SS in temporal lobe was decreased significantly in MDG group(2.73±0.96)compared with that in S

9、OG group (12.93±1.67), P0.05 , the expression of nNOS in hippocampus was increased significantly in MDG group(29.60±2.03)compared with that in SOG group (9.33±1.63), P0.05, the expression of nNOS in temporal lobe was increased significantly in MDG group(28.87±2.47)compared with t

10、hat in SOG group (8.40±1.64), P0.05. Conclusions The abilities of learning and memory of VD rats with are reduced, and the ultrastructure in the brain are significantly changed, the level of SS in the brain is decreased, the nNOS expression is increased.【Key words】 Vascular dementia;Water maze

11、test;Transmission electron microscopy; Somatostatin;Nitric oxide synthase 血管性癡呆(vascular dementia，VD)發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前尚無(wú)有效方法和藥物控制病程進(jìn)展。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎能造成大鼠明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙1。本文通過(guò)雙側(cè)永久性結(jié)扎老齡大鼠頸總動(dòng)脈，建立VD動(dòng)物模型，觀察VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)以及海馬、顳葉皮層生長(zhǎng)抑素(SS)及一氧化氮合酶(NOS)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況，探討VD的發(fā)病機(jī)制。1 材料與方法1.1 動(dòng)物模型的制備 SD大鼠30只，體重約450550 g

12、，1415 w，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將SD大鼠隨機(jī)分為模型組(MDG)及假手術(shù)組(SOG)。MDG組根據(jù)Olsson方法2，術(shù)前12 h禁食、6 h禁水。10%水合氯醛(0.30 ml/100g)腹腔注射麻醉，頸前部去毛，消毒后沿腹側(cè)頸正中切開(kāi)，氣管旁分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以“0”號(hào)線雙重結(jié)扎頸總動(dòng)脈。SOG組動(dòng)物行頸前切開(kāi)，分離但不結(jié)扎頸總動(dòng)脈。1.2 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試(Morris水迷宮)3 分為定位航行實(shí)驗(yàn)及空間搜索實(shí)驗(yàn)兩部分。定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，第1天讓大鼠自由游泳2 min;從第2天起，每天分上、下午兩段，每段訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練間隔為60 s。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)

13、入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)時(shí)所需時(shí)間(即潛伏期)。如果大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期計(jì)為120 s?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)：在第5天最后一次訓(xùn)練后撤除水下平臺(tái)，在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測(cè)其在120 s內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。術(shù)后61 d按上述方法進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測(cè)試，按癡呆標(biāo)準(zhǔn)以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期的平均值作為參考值，計(jì)算VD大鼠逃避潛伏期的平均值與參考值之差占該鼠逃避潛伏期的比值，若該值大于20%為癡呆鼠。1.3 電鏡標(biāo)本的制備 大鼠斷頭處死后，參照大鼠腦圖譜，迅速切取右側(cè)海馬區(qū)組織塊，迅速放入4預(yù)冷的4%戊二醛中固定，常規(guī)脫水、Ep

14、on812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，LKB超薄切片,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，應(yīng)用日立H7500型透射電鏡觀察。1.4 免疫組化試劑及方法 SS兔抗大鼠多克隆抗體、神經(jīng)元型NOS (nNOS)兔抗大鼠多克隆抗體、免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶(SP)試劑盒(均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)，采用SP免疫組化技術(shù)，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。將石蠟包埋組織連續(xù)4 m切片，常規(guī)二甲苯脫臘，梯度酒精水化，進(jìn)行微波抗原修復(fù)，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。在海馬CA1區(qū)及顳葉皮層，分區(qū)選擇3個(gè)相鄰視野，在400倍光鏡下作免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)，結(jié)果取3個(gè)視野的平均值。1.5 統(tǒng)

15、計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)采用運(yùn)用SPSS11.5醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。2 結(jié) 果2.1 行為學(xué)測(cè)試 應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)進(jìn)行比較，結(jié)果表明MDG組大鼠的逃避潛伏期較SOG組明顯延長(zhǎng)(P0.05)，MDG組大鼠的跨平臺(tái)次數(shù)較SOG組明顯減少(P0.05)，見(jiàn)表1，說(shuō)明VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低。表1 水迷宮試驗(yàn)中小鼠的學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)與SOG組比較：1)P0.05，下表同2.2 透射電鏡觀察 SOG組可見(jiàn)神經(jīng)元核膜完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)溶酶體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。MDG組可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞高度水腫，細(xì)胞核變性，核固縮或崩解;線粒體腫

16、脹，嵴的雙層膜結(jié)構(gòu)不清、斷裂、萎縮，重者線粒體高度空泡化，正常線粒體少見(jiàn);粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重脫顆粒。見(jiàn)圖1。2.3 海馬區(qū)及顳葉皮層區(qū)SS、nNOS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果表明，與SOG組比較MDG組SS的表達(dá)明顯下降(P0.05)，nNOS的表達(dá)明顯增加(P0.05)，見(jiàn)表2、圖2。表2 海馬區(qū)及顳葉皮層區(qū)SS、nNOS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況3 討 論智能障礙是VD的主要癥狀，其中學(xué)習(xí)記憶能力減退尤為明顯。本研究行為學(xué)結(jié)果顯示，MDG組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)也明顯減少，表明VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致1。本研究透射電鏡觀察MDG組可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞高度水腫，細(xì)胞核變性，核固縮或

17、崩解;線粒體腫脹，嵴的雙層膜結(jié)構(gòu)不清、斷裂、萎縮，重者線粒體高度空泡化，正常線粒體少見(jiàn);粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重脫顆粒。結(jié)果顯示，MDG組大鼠行為障礙的程度與海馬神經(jīng)元變性、水腫程度平行。SS為從下丘腦分離出來(lái)的能抑制生長(zhǎng)激素分泌的14氨基肽，具有激素和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重作用。作為一種神經(jīng)遞質(zhì)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，參與了學(xué)習(xí)和記憶的過(guò)程，其含量降低與癡呆存在明顯相關(guān)性。早期研究發(fā)現(xiàn)癡呆者皮質(zhì)、基底核、邊緣系統(tǒng)SS含量明顯降低。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道多梗塞性癡呆(MID)患者CSF中SS降低與癡呆程度呈正相關(guān)4，還有人認(rèn)為SS神經(jīng)元的損害可能是癡呆神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生紊亂的最早啟動(dòng)環(huán)節(jié)5。本研究結(jié)果顯示MDG組在海

18、馬區(qū)及顳葉皮層區(qū)SS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，證實(shí)SS表達(dá)減少與VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能減退有密切關(guān)系，提示SS參與了VD的病理過(guò)程，與文獻(xiàn)報(bào)道一致6。SS在VD發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為SS調(diào)控學(xué)習(xí)和記憶的途經(jīng)可能與直接興奮SS能神經(jīng)元引起鈣離子內(nèi)流增加有關(guān);此外，也可能由于SS能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元相距很近，SS可促進(jìn)乙酰膽堿釋放從而影響學(xué)習(xí)和記憶功能。NO是一種血管活性物質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有保護(hù)和毒性雙重作用，外源性或內(nèi)源性的NO過(guò)量產(chǎn)生或釋放時(shí)具有神經(jīng)毒性，其與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系集中表現(xiàn)為NO在小腦、海馬長(zhǎng)時(shí)程突觸增強(qiáng)(LTP)中的作用。腦內(nèi)NOS至少有3型7：在神經(jīng)元表達(dá)的nNO

19、S，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)表達(dá)的誘導(dǎo)型NOS (iNOS )和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)皮型NOS(eNOS)。在缺血性腦損傷中3種不同的NOS 催化產(chǎn)生的NO起著不同的作用，其中nNOS催化產(chǎn)生NO參與腦缺血后神經(jīng)元損傷。nNOS是一種鈣依賴性NOS，其活性受細(xì)胞內(nèi)Ca濃度的影響，在正常生理情況下催化產(chǎn)生的NO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間信使分子，可促進(jìn)LTP的形成，在學(xué)習(xí)記憶機(jī)制中具有重要作用。腦缺血時(shí)谷氨酸釋放增加，使NMDA受體依賴的Ca通道過(guò)度激活，大量Ca內(nèi)流并與CaM結(jié)合，當(dāng)神經(jīng)元內(nèi)Ca濃度達(dá)0.11 mol/L時(shí)，受到CaCaM直接調(diào)節(jié)的NOS被大量激活，導(dǎo)致

20、合成過(guò)量的NO,產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。Huang等8實(shí)驗(yàn)確定了nNOS的神經(jīng)毒性作用，NOS抑制劑能對(duì)抗腦培養(yǎng)和腦切片中N甲基D天冬氨酸(NMDA )毒性9。Hara等10在短暫局灶腦缺血中，檢測(cè)nNOS和eNOS缺失動(dòng)物NOS結(jié)合率，發(fā)現(xiàn)缺血與NMDA導(dǎo)致nNOS表達(dá)增多，過(guò)度表達(dá)的nNOS在缺血和興奮性毒性損傷起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示老齡大鼠持續(xù)缺血2個(gè)月后出現(xiàn)明顯的空間分辨學(xué)習(xí)記憶障礙，同時(shí)皮層和海馬nNOS表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，表明此時(shí)皮層和海馬內(nèi)NO的持續(xù)生成和釋放，提示nNOS不僅參與缺血性腦損傷，而且在癡呆形成的過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告相一致11。綜上，本研究首次

21、觀察老年VD大鼠腦內(nèi)超微結(jié)構(gòu)明顯變化，腦內(nèi)SS表達(dá)水平的下降、nNOS表達(dá)水平的增高，可能與認(rèn)知有關(guān)。有關(guān)SS與nNOS在VD發(fā)病機(jī)制的作用有待進(jìn)一步深入的研究探索。【參考文獻(xiàn)】1 姜曉蕊,盧 宏.17雌二醇對(duì)血管性癡呆大鼠BDNF表達(dá)的影響J.實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2005;8(2)：3941.2 Olsson Y，Brun A，Engiuund E.Fundamental pathological lesions in vascular dementiaJ.Acta Neurol Suppl，1996;168:318.3 Morris R.Developments of a water maze procedure for studying spatial learning in the ratJ.J Neurosic Methods,1984;11(1):4760.4 Molins A，Catalan R，Sahuquilb J,et al.Somatostai