鳥嘌呤論文MGMT與腫瘤的預(yù)見性化療

1、鳥嘌呤論文|MGMT與腫瘤的預(yù)見性化療    </b>                           來(lái)源:免費(fèi)論文網(wǎng)                2006-11-16 10:44:00 網(wǎng)友評(píng)論  條       字體

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3、60;                                                                    

4、60;         1 F2 q; Y! U7 4 r8 </h1>                      作者;章?lián)P培，鮑國(guó)強(qiáng)，任會(huì)明，季守平6 X) n4 W  X' T) Q O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA-transferase，MGMT)，是細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的一種酶，這種酶又被稱為O6-烷基鳥嘌

5、呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(AGAT)。顧名思義，此酶可以修復(fù)由各種烷化劑(alkylating agents)造成的細(xì)胞DNA烷基化損傷，特別是DNA分子中鳥嘌呤第6位氧原子上的甲基乃至烷基化損傷。根據(jù)MGMT基因及其表達(dá)水平的不同，將細(xì)胞特別是腫瘤細(xì)胞分成Mer和Mer兩種類型：Mer對(duì)烷化劑耐藥，Mer對(duì)烷化劑敏感，即細(xì)胞中的MGMT水平?jīng)Q定了細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥程度；接著家集中精力如何克服Mer細(xì)胞耐藥性的，發(fā)現(xiàn)O6-BG可以有效克服Mer細(xì)胞對(duì)烷化劑耐藥性。這些研究為開展甲基轉(zhuǎn)移酶MGMT與腫瘤預(yù)見性、個(gè)體化奠定了基礎(chǔ)。$   h# s% m& N5 B. i9 J

6、9 v    " d( N) h. J9 z    1  MGMT與腫瘤預(yù)見性、個(gè)體化治療0 X% q6 a3 '( B    . R2 F, X3 |) V) ( F% T    化療是治療腫瘤的有效手段之一?；熜Ч闹饕獑?wèn)題是克服腫瘤對(duì)藥物的耐藥性。因此在化療之前，預(yù)先判斷患者對(duì)藥物是否耐藥是實(shí)施腫瘤預(yù)見性、個(gè)體化化療的前提。烷化劑類化療藥物占國(guó)產(chǎn)的化療藥物的1/4，這類藥物的作用機(jī)制明確，廣泛用于治療腦、頭頸、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等惡性腫瘤。烷化劑藥物主要攻擊

7、細(xì)胞的DNA，造成DNA烷基化損傷，進(jìn)而形成DNA交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在12種DNA烷化損傷中，以O(shè)6-甲基鳥嘌呤DNA的損傷威脅最大，是引起細(xì)胞致死的重要原因。報(bào)道細(xì)胞內(nèi)的O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可使DNA烷基化特別是甲基化的損傷得到修復(fù)，是細(xì)胞對(duì)烷化劑藥物產(chǎn)生耐藥性的根本原因13。如果能夠建立檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中MGMT的，就可以依據(jù)MGMT酶活性或酶蛋白水平的高低，合理使用烷化劑類藥物：即對(duì)MGMT蛋白水平低的腫瘤直接使用烷化劑化療，而對(duì)MGMT蛋白水平高的耐藥的腫瘤，設(shè)法降低其MGMT蛋白水平，破壞其耐藥的分子基礎(chǔ)，然后使用烷化劑治療。人腫瘤細(xì)胞中MGMT是如何分布的、腫瘤患者M(jìn)GM

8、T的分布有什么、能否通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MGMT蛋白水平高低與對(duì)藥物耐藥或敏感的相關(guān)性、能否研制出MGMT診斷試劑盒、能否研制出更有效的烷化劑類治療藥物嘧啶亞硝脲(ACNU，尼莫斯汀)、能否研制出克服腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑特別是對(duì)亞硝脲耐藥的藥物，如這些問(wèn)題得到解決，就可以形成以腫瘤病人MGMT為依據(jù)、以調(diào)節(jié)MGMT為手段，對(duì)MGMT蛋白水平不同的病人，實(shí)施不同的使用烷化劑治療的方案，實(shí)現(xiàn)預(yù)見性、個(gè)體化化療。0 & m* '0 6 R7 ) B7 W  R0 h    8 ?- a) J  V5 c4 # u% y7 b# Z&

9、amp; A0 ?    自1987年始，歷經(jīng)14年，我們先后進(jìn)行了20株中國(guó)人腫瘤細(xì)胞系MGMT酶活性與對(duì)烷化劑亞硝脲耐藥性的分析、裸鼠治療實(shí)驗(yàn)、MGMT基因結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄、MGMT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)耐藥性的影響、初步的臨床治療實(shí)驗(yàn)等，率先提出了分析甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白水平，進(jìn)行腫瘤預(yù)見性、個(gè)體化化療的方案，并研制出國(guó)家一類新藥甲基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒，研制出相應(yīng)的治療藥物嘧啶亞硝脲(尼莫斯汀)和克服耐藥性的藥物鏈脲菌素(鏈佐星)，實(shí)現(xiàn)了與此方案相關(guān)的藥物全部配套并國(guó)產(chǎn)化，為推行以分析腫瘤病人MGMT為依據(jù)，以調(diào)節(jié)MGMT為手段，對(duì)MGMT蛋白水平不同的病人，實(shí)施不同的使用烷化劑治療的方案，奠

10、定了基礎(chǔ)。% s4 U" C: X; H; Q& V# J    $ p3 s& s6 d* f    我們收集和培養(yǎng)了20株中國(guó)人腫瘤細(xì)胞，包括肝癌4株、肺癌4株、鼻咽癌2株、腦瘤2株、胃癌2株、惡性黑色素瘤、直腸癌、舌癌、乳腺癌、食管癌和宮頸癌各1株，以國(guó)際公認(rèn)的HeLa S3(Mer+型)和HeLa MR(Mer-型)細(xì)胞為對(duì)照，測(cè)定了它們的MGMT酶活性，及烷化劑ACNU和BCNU處理后的細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)證明20株中國(guó)人腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑亞硝脲的敏感性呈3種類型：第一類敏感型，如SHG-44腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞；第二類抗性型，

11、如BGC-823胃癌、BEL-7402肝癌和SMMC-7721肝癌細(xì)胞；第三類中間型。在20株中國(guó)人腫瘤細(xì)胞中，MGMT活性低的2株，占10%。這一結(jié)果與美國(guó)Scudiero報(bào)道的MGMT活性低的細(xì)胞為20%(19/93)4，日本Ikenaga報(bào)道的為15%(6/40)5基本相當(dāng)。進(jìn)一步的MGMT酶活性分析揭示，在實(shí)驗(yàn)的20株細(xì)胞中，對(duì)亞硝脲敏感型的SHG-44和HeLa MR細(xì)胞的MGMT酶活性最低；對(duì)亞硝脲呈抗性的BGC-823、BEL-7402、SMMC-7721和HeLa S3細(xì)胞的酶活性都很高。如果用細(xì)胞存活率為10%時(shí)所對(duì)應(yīng)的藥物濃度(D10值)作為衡量細(xì)胞對(duì)藥物敏感性的指標(biāo)，則細(xì)

12、胞D10值與MGMT酶活性之間有很好的線性關(guān)系，MGMT酶活性高的細(xì)胞對(duì)亞硝脲有抗性，MGMT酶活低的細(xì)胞對(duì)亞硝脲藥物敏感(見圖1)。說(shuō)明MGMT酶活性高低是決定腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑耐藥性的分子基礎(chǔ)。# a. V$ D; d8 i: u9 : h/ e( C    8 u3 l7 t! # d/ B1 ',     為了進(jìn)一步觀察腫瘤細(xì)胞MGMT酶活性與使用烷化劑藥物治療效果的關(guān)系，Watatani把MGMT酶活高和酶活低的兩種不同腫瘤細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)，然后使用單功能烷化劑MNNG治療，結(jié)果MGMT低的腫瘤明顯治愈，而MGMT高的腫瘤表現(xiàn)出耐藥性6。

13、我們將1×107MGMT低的HeLa MR細(xì)胞以及中國(guó)人SHG-44腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，相同數(shù)量的MGMT高的HeLa S3和SMMC-7721中國(guó)人肝癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，待成瘤后按每克鼠體重腹腔注射25g烷化劑ACNU的劑量進(jìn)行治療，每周1次，連續(xù)4周；或?qū)CNU的劑量提高到50g/次，治療2次。HeLa MR和SHG-44腫瘤移植物消失，繼續(xù)觀察1個(gè)月未見復(fù)發(fā)，治療效果十分理想。而烷化劑ACNU對(duì)MGMT高的HeLa S3和SMMC-7721腫瘤移植物則無(wú)治療效果，腫瘤移植物越長(zhǎng)越大(見圖2)。光學(xué)顯微鏡和顯微鏡觀察證明，從裸鼠體內(nèi)剝離出的治愈的MGMT低的腫瘤殘存物中，僅能見到明

14、顯壞死的細(xì)胞和少量纖維細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明烷化劑ACNU對(duì)MGMT低的腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷; I6 p- d  A* X , T* Q0 _# # s& S* H& F9 6 I( q4 X" E7 y4 G! _; 圖1  中國(guó)人腫瘤細(xì)胞MGMT活性與對(duì)ACNU敏感性關(guān)系9 c" H+ P0 g" + l( N9 x1.HeLa MR/HeLa S3(ACNU 0，對(duì)照);2.HeLa MR/HeLa S3(ACNU 25g/g×4);9.HeLa MR/HeLa MR(ACNU 50g/

15、g×2);& U/ Y8 I/ O# V) " n - E% z5 u8 s8 C: f2 f& D' ) t' 5 y, X( Z* d. 圖2  ACNU對(duì)人腫瘤移植物的治療效果; B8 N5 W: ; o4 d4 q4 H+ Y; o. (   P5 S, 0 Q    作用，進(jìn)一步證明腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥性與MGMT酶活性相關(guān)。提示如果能檢測(cè)并確定腫瘤細(xì)胞中MGMT酶活的高低，就有可能預(yù)見烷化劑藥物的治療效果。6 n* ! D% q! O( g. P7 ?/ _7 s

16、60;   0 |$ G* z% q, d, N0 B8 w    另一類常用烷化劑順鉑的治療效果也與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的MGMT酶活性相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道順鉑可降低MGMT酶活與酶蛋白水平，克服腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑氮烯咪胺(DTIC)、替莫唑胺(TMZ)的耐藥性7。MGMT酶可修復(fù)順鉑造成的腫瘤細(xì)胞染色體SCE，對(duì)抗順鉑藥物作用；MGMT酶活高的腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥，MGMT酶活低的細(xì)胞對(duì)順鉑敏感8。更有實(shí)驗(yàn)證明使用順鉑和環(huán)磷酰胺對(duì)卵巢癌的治療效果與腫瘤細(xì)胞中的MGMT酶活性相關(guān)9。環(huán)磷酰胺、順鉑和亞硝脲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明細(xì)胞的MGMT酶活性，決定了烷化劑藥物對(duì)腫瘤的治療效果。8

17、q4 C' U- |2 '1 |8 ' G    5 s. v# F1 T( t! R( O: m% D    不同的腫瘤細(xì)胞MGMT酶活性不同，有的高，有的低。腫瘤病人的腫瘤組織中MGMT酶活性是否也存在個(gè)體差異呢？我們分析了74例不同類型的腫瘤組織中MGMT酶活性，包括乳腺癌9例，胃癌、小細(xì)胞肺癌、腎癌、食管癌和結(jié)腸癌各5例，非小細(xì)胞肺癌24例，腦瘤14例及惡性黑色素瘤2例。發(fā)現(xiàn)在這些腫瘤組織中MGMT酶活性由高到低的順序?yàn)槿橄侔?gt;胃癌>小細(xì)胞肺癌>非小細(xì)胞肺癌>腎癌>腦瘤>食管癌>結(jié)

18、腸癌>惡性黑色素瘤，這種組織分布規(guī)律性與臨床使用烷化劑治療腫瘤的經(jīng)驗(yàn)基本吻合，即烷化劑藥物多用于治療酶活性低的腫瘤。同時(shí)我們還觀察到即使在同種腫瘤組織中MGMT酶活性也有個(gè)體差異。在74例標(biāo)本中有6例MGMT酶活性極低，包括食管癌3例，肺腺癌、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和結(jié)腸癌各1例，約占8.1%。這一結(jié)果與日本Isowa觀察到21例肝癌中，MGMT低的占9.5%10；意大利Frosina觀察到27例腦瘤中MGMT活性低的占7.4%的結(jié)果相當(dāng)吻合11。不同個(gè)體MGMT活性不同，必然對(duì)烷化劑的治療效果不同。如果對(duì)這些MGMT低的患者使用烷化劑藥物治療，就有可能獲得滿意的療效。而對(duì)那些MGMT高的腫瘤患

19、者，如能設(shè)法降低其MGMT水平，就有可能克服其對(duì)烷化劑的耐藥性，獲得較好的治療效果。對(duì)MGMT酶活不同的腫瘤患者，實(shí)施不同的化療方案，即個(gè)體化治療方案，不僅可以減輕病人的痛苦，而且可以提高化療的水平。- ?$ j6 Q$ B* Y) J( C/ V6 w4 G, s    8 Z" 9 8 s) A( F7 V! p    據(jù)此，我們進(jìn)一步構(gòu)建了含人MGMT cDNA和選擇標(biāo)記neo基因的真核表達(dá)載體pSV2MGMT-neo，并利用電穿孔基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其導(dǎo)入MGMT基因表達(dá)水平低的HeLa MR腫瘤細(xì)胞中，希望觀察導(dǎo)入MGMT cDNA是否可以

20、改變Mer-型腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥性，經(jīng)篩選獲得了MGMT cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明5個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中有4個(gè)MGMT酶活性和MGMT mRNA表達(dá)水平均比轉(zhuǎn)染前顯著提高，隨之帶來(lái)的結(jié)果是轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)雙功能烷化劑ACNU和單功能烷化劑MNNG的耐藥性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明人MGMT基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥性有直接的關(guān)系，MGMT mRNA和MGMT蛋白表達(dá)水平的提高是腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑藥物產(chǎn)生耐藥性的直接原因。4 y, b" m6 P      6 X+ Z) N' . r1 z0 f; R    2 

21、; 聯(lián)合用藥克服腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥性4 O2 |$ F, W9 w    4 a7 I7 q$ D( d+ K    以上實(shí)驗(yàn)充分證明MGMT mRNA、MGMT酶蛋白和酶活性的高低決定了腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥性。MGMT高耐藥，MGMT低敏感。這就提示如果能降低或消耗腫瘤細(xì)胞的MGMT酶活性和蛋白水平，就有可能克服腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐藥性。我們選用3株Mer+型腫瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料(包括HeLa S3，SMMC-7721和Cc801)，這3株細(xì)胞的MGMT活性均較高，因此對(duì)ACNU和BCNU烷化劑類藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。我們觀察了使用

22、鏈脲菌素(Streptozotocin，STZ)對(duì)Mer+型細(xì)胞耐藥性的改變，3株Mer+型腫瘤細(xì)胞于37用鏈脲菌素處理1h后，細(xì)胞的MGMT活性明顯降低。當(dāng)STZ的濃度為1.5mmol/L時(shí)，可使HeLa S3的MGMT活性從1.10pmol/mg降到0.59pmol/mg；當(dāng)STZ的濃度為1.0mmol/L時(shí)，可使SMMC-7721的MGMT活性由0.77降到0.39；當(dāng)STZ濃度為0.5mmol/L時(shí)，可使Cc801的MGMT活性從0.39降到0.14。這3株細(xì)胞MGMT酶活性下降后，細(xì)胞對(duì)ACNU的耐藥性也隨之降低，D10值的改變：HeLa S3從114g/ml降到68g/ml，SMMC-7721從77g/ml降到47g/ml，Cc801從39g/ml降到23g/ml；如果STZ的濃度提高到3.0mmo