醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南

1、醫(yī)療器械無(wú)菌實(shí)驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南 <2018 版）無(wú)菌檢驗(yàn)是無(wú)菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過(guò)程中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。其檢 驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果判定及檢驗(yàn)人員業(yè)務(wù)能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和 安全。作為無(wú)菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)，其無(wú)菌檢驗(yàn)工作應(yīng)由本企業(yè)獨(dú)立完 成。本指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員增強(qiáng)對(duì)無(wú)菌檢驗(yàn)相關(guān)知 識(shí)的認(rèn)識(shí)，指導(dǎo)和規(guī)范全市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員對(duì)醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)無(wú) 菌檢驗(yàn)過(guò)程控制水平的監(jiān)督檢查工作，同時(shí)，為醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)<以下簡(jiǎn)稱(chēng)生產(chǎn)企業(yè)）在無(wú)菌檢驗(yàn)的過(guò)程管理要求提供參考和依據(jù)。當(dāng)國(guó)家相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、檢查要求發(fā)生變化時(shí)，應(yīng)重新修訂本指南。一、適用范圍本指南適用于北京市藥品監(jiān)督管

2、理局組織、實(shí)施的醫(yī)療器械生產(chǎn)企 業(yè)許可證核發(fā)、變更、換證等現(xiàn)場(chǎng)檢查、醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系考核、 醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范檢查、醫(yī)療器械生產(chǎn)日常監(jiān)督等各項(xiàng)涉無(wú)菌檢 驗(yàn)的檢查。二、檢查內(nèi)容 檢查人員應(yīng)在充分了解生產(chǎn)企業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)活動(dòng)的情況下，對(duì)其無(wú)菌檢 驗(yàn)過(guò)程的控制水平進(jìn)行客觀的檢查和評(píng)價(jià)。一般情況下，檢查人員可按照以下順序開(kāi)展檢查工作，并適時(shí)做好相 關(guān)記錄：1、了解產(chǎn)品特性及生產(chǎn)企業(yè)選擇的無(wú)菌檢驗(yàn)方法。常見(jiàn)的產(chǎn)品無(wú)菌 檢查法包括直接接種法和薄膜過(guò)濾法。當(dāng)建立產(chǎn)品的無(wú)菌檢查方法時(shí)，生 產(chǎn)企業(yè)應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法能夠給出正確的結(jié)果。若 該產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新

3、驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)， 應(yīng)按供試品無(wú)菌檢查的規(guī)定及有關(guān)要求進(jìn)行操作。對(duì)藥典規(guī)定的每一實(shí)驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也可與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。2、了解檢驗(yàn)人員的專(zhuān)業(yè)背景、培訓(xùn)情況及工作經(jīng)歷。可通過(guò)查看學(xué) 歷證書(shū)、培訓(xùn)證書(shū)或當(dāng)面詢(xún)問(wèn)檢驗(yàn)人員的方式，檢查無(wú)菌檢驗(yàn)人員是否具 備微生物專(zhuān)業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)的培訓(xùn)。3、現(xiàn)場(chǎng)察看無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室。無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度 10000 級(jí)下的局 部潔凈度 100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi) 如在萬(wàn)級(jí)潔凈間內(nèi)配置超凈工作臺(tái) 等）中進(jìn)行，其全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流 空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期監(jiān)測(cè)。4、現(xiàn)場(chǎng)察看無(wú)菌實(shí)驗(yàn)所需的設(shè)備和器具。其中， 主要設(shè)

4、備包括：恒溫培養(yǎng)箱 真菌、細(xì)菌）、恒溫水浴箱、壓力蒸汽 滅菌器、電熱干燥箱、電子天平、光學(xué)顯微鏡、集菌儀、過(guò)濾裝置無(wú)油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）等；從實(shí)驗(yàn)安全性考慮，建議陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)使用生物安全柜）主要器具有：試管及試管架、酒精燈、 75乙醇棉、滅菌刻度吸管（1ml、滅菌平皿v9cm）、錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、鑷子等。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)采用可靠方法對(duì)與供試液接觸的所有器具滅菌，通常置壓 力蒸汽滅菌器內(nèi)121 C 30分鐘，或置電熱干燥箱內(nèi)160C 2小時(shí)。器具滅 菌后必須做好標(biāo)識(shí)，標(biāo)明滅菌的時(shí)間和使用有效期。器皿在滅菌后，最多 1 周即用完。檢查時(shí)還應(yīng)注意清點(diǎn)培養(yǎng)皿的個(gè)數(shù)，與實(shí)驗(yàn)記

5、錄中反映的培 養(yǎng)基個(gè)數(shù)是否一致。5、對(duì)照生產(chǎn)企業(yè)有關(guān)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)的管理制度、操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文 件，要求檢驗(yàn)人員當(dāng)場(chǎng)操作或口述無(wú)菌檢驗(yàn)的過(guò)程。1 ）培養(yǎng)基制備 生產(chǎn)企業(yè)可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符 合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2C 25C、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在 3 周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在 1 年內(nèi)使用。無(wú)菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng) 基的無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無(wú)菌檢查前或與 供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。2）供試品的無(wú)菌檢查 無(wú)菌檢查法包

6、括薄膜過(guò)濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng) 采用薄膜過(guò)濾法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證 的方法相同。無(wú)菌實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等 試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無(wú)毒性。無(wú)菌操作時(shí)，對(duì)供試品容器表面應(yīng)用適宜的消毒液進(jìn)行徹底消毒，如 果供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無(wú)菌器材如帶有除菌過(guò)濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)入無(wú)菌空氣，再按無(wú)菌操作起開(kāi)容器取出內(nèi)容物。3）培養(yǎng)及觀察含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng) 14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄 是否有菌生長(zhǎng)。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁， 培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無(wú)微生物生長(zhǎng)

7、，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種 至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng) 2天、真菌培養(yǎng) 3天，觀察接種的同種新鮮 培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。在觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果的過(guò)程中，還應(yīng)考慮假陰性的影響。其中影響假陰性 發(fā)生的因素有：培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長(zhǎng)促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)）；在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)品中釋放出了殺菌或微生物電解的物質(zhì)消除抑菌物質(zhì)）；從滅菌處理到培養(yǎng)有一定的時(shí)間間隔 確定滅菌后產(chǎn)品的儲(chǔ)存條件及儲(chǔ)存時(shí) 間）。4）結(jié)果判斷生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合 規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合 規(guī)定，除非能充

8、分證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含。陽(yáng) 性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長(zhǎng)，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效：無(wú)菌檢查實(shí)驗(yàn) 所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求；回顧無(wú) 菌實(shí)驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；供試品管中生長(zhǎng)的微 生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌實(shí)驗(yàn)中所使用的物品和 <或）無(wú)菌操作技術(shù) 不當(dāng)引起的。實(shí)驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重 試，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī) 定。6、查閱實(shí)驗(yàn)記錄。完整的實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)明確包含下列幾類(lèi)信息： <1）樣品記錄，至少應(yīng)包

9、括：取樣日期、樣品名稱(chēng)、樣品規(guī)格、樣品 批號(hào)、取樣地點(diǎn)、取樣方式、取樣人、原始實(shí)驗(yàn)記錄序號(hào)。<2）滅菌物品制作記錄 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱(chēng)、培養(yǎng)基批號(hào)、培養(yǎng)基用量 <g）、蒸餾水用量 vml）、培養(yǎng)基分裝數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和壓力、滅菌時(shí) 間、制作人、培養(yǎng)基存放地點(diǎn)和有效期等。 器具：器具名稱(chēng)、器具數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和壓力、 滅菌時(shí)間、制作人、器具存放地點(diǎn)、有效期等。<3）原始實(shí)驗(yàn)記錄，至少應(yīng)包括：記錄名稱(chēng)、記錄序號(hào)、樣品名稱(chēng)、 樣品唯一性標(biāo)識(shí) <例如：樣品號(hào)）、樣品規(guī)格、樣品批號(hào)、滅菌批號(hào)、樣 品數(shù)量、取樣日期、檢驗(yàn)日期、檢驗(yàn)依據(jù)、主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器具

10、、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 每日觀察的結(jié)果）、實(shí)驗(yàn)結(jié)論、檢測(cè)人、 復(fù)核人等。4）廢棄物處理記錄，至少應(yīng)包括：廢棄物形態(tài) 固體、液體）、廢 棄物數(shù)量、滅菌時(shí)間和壓力、經(jīng)辦人、處理日期等。三、其它應(yīng)注意的問(wèn)題1、生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確保樣品具有代表性：實(shí)驗(yàn)樣品應(yīng)從常規(guī)產(chǎn)品中能夠 代表加工過(guò)程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機(jī)的。實(shí)驗(yàn)樣品的選擇和 處理技術(shù)應(yīng)明確，以免對(duì)樣品上所含的微生物的數(shù)量和種類(lèi)造成污染和改 變。實(shí)驗(yàn)樣品可以選擇制造過(guò)程中的不合格產(chǎn)品，它們應(yīng)該代表這個(gè)生產(chǎn) 批的加項(xiàng)目序和條件。用于實(shí)驗(yàn)的不合格產(chǎn)品應(yīng)不會(huì)影響無(wú)菌測(cè)試的有效 性。2、生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過(guò)程要采取防止污染措施，

11、確 保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。選取制作供試品的實(shí)驗(yàn)樣品時(shí)，樣品包裝須完好無(wú) 損，尤其是只有一層包裝的樣品。進(jìn)入無(wú)菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗或緩沖間）拆除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。3、無(wú)菌檢驗(yàn)中接觸供試品的實(shí)驗(yàn)用具溫度不能過(guò)高以防可能存在的 菌被燙死。對(duì)不同種類(lèi)和不同批次的產(chǎn)品，在拆包裝及夾取樣品時(shí)，應(yīng)更 換實(shí)驗(yàn)用具 如：剪刀、鑷子）。4、進(jìn)入無(wú)菌操作室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應(yīng)采用適用的 方法進(jìn)行消毒處理 如：紫外燈照射不少于 30 分鐘），以避免將外包裝污 染的微生物帶入無(wú)菌檢驗(yàn)室。出具實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，所有培養(yǎng)物須經(jīng)121 C高壓滅菌 30 分鐘的處理。5、因?yàn)闊o(wú)菌檢驗(yàn)時(shí)

12、間跨度較長(zhǎng)，因此過(guò)程的記錄應(yīng)能夠完整體現(xiàn)實(shí) 驗(yàn)的全過(guò)程，對(duì)于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的各種情況，均應(yīng)在記錄中客觀反映。參考資料一：常見(jiàn)的名詞解釋1、滅菌：殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過(guò)程。目前國(guó) 際上規(guī)定，滅菌過(guò)程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6 及以下。2、微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實(shí)體，包括細(xì)菌、真菌、原 生動(dòng)物和病毒。3、無(wú)菌技術(shù)：是指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類(lèi)微生物的 污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無(wú)菌環(huán)境設(shè)施、無(wú) 菌實(shí)驗(yàn)器材以及無(wú)菌操作。4、無(wú)菌操作：是指在無(wú)菌環(huán)境條件下，在對(duì)無(wú)菌制品或無(wú)菌器械進(jìn) 行檢驗(yàn)的過(guò)程中，能防止微生物污染與干擾

13、的一種常規(guī)操作方法。5、培養(yǎng)條件：用于促進(jìn)微生物發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和培 養(yǎng)方式的組合。6、需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。7、厭氧菌：在代謝中，沒(méi)有氧的條件下才能生存的微生物。8、抑細(xì)菌 / 抑霉菌實(shí)驗(yàn)：用選定的微生物來(lái)演示某些物質(zhì)的存在能夠 抑制這些微生物的繁殖。9、促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)：用于證明生長(zhǎng)培養(yǎng)基能夠支持微生物生長(zhǎng)的技術(shù)操 作。10、假陰性：實(shí)際陽(yáng)性的無(wú)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果被變成了陰性。11、假陽(yáng)性：實(shí)際陰性的無(wú)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果被變成了陽(yáng)性。12、生物指示物：對(duì)特定滅菌工藝有確定的抗力，可供使用的微生物 檢驗(yàn)器材。13、化學(xué)指示物：根據(jù)暴露于某種滅菌工藝所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化，在一個(gè)

14、或多個(gè)預(yù)定工藝參數(shù)上顯示變化的指示器材。14、無(wú)菌保證水平 <SAL): 滅菌后產(chǎn)品上存在單個(gè)活微生物的概率參考資料二：無(wú)菌室空氣中菌落數(shù)的檢查無(wú)菌室在消毒處理完畢后，應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)。方法如下：取直 徑約90mm培養(yǎng)皿，無(wú)菌操作注入融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20mL在30C35C培養(yǎng)48小時(shí)證明無(wú)菌后，取3只培養(yǎng)皿在無(wú)菌室操作臺(tái)或超 凈工作臺(tái)平均位置打開(kāi)上蓋，暴露 30分鐘后蓋好，置30C35C培養(yǎng)48 小時(shí)后取出檢查，3只雙碟上生長(zhǎng)的菌落數(shù)平均不得超過(guò) 1個(gè)。無(wú)菌實(shí)驗(yàn) 過(guò)程中應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)，方法同上。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始進(jìn)行時(shí)打開(kāi)平皿 蓋，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束蓋好照上法培養(yǎng)，應(yīng)符合上述要求。參考資

15、料三：供試品數(shù)量的選擇檢驗(yàn)數(shù)量是指一次實(shí)驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定 外，出廠產(chǎn)品按藥典附錄X皿 B中表1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2、表 3規(guī)定。表1、表2、表3中最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的供試品用 量。一般情況下，供試品無(wú)菌檢查若采用薄膜過(guò)濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽(yáng)性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支 或瓶）作陽(yáng)性對(duì)照用。執(zhí)行GB/T14233.2的供試品數(shù)量應(yīng)滿(mǎn)足同一批號(hào)311個(gè)單 位供試品。檢驗(yàn)量是指一次實(shí)驗(yàn)所用的供試品總量 g或ml）。除另有規(guī)定外，每 份培養(yǎng)基接種的供試品量按表2、表3規(guī)定。若每支 瓶）供試品的裝量按 規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則

16、應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬 丁培養(yǎng)基。采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的總接種量， 只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾。表1批出廠產(chǎn)品最少量檢驗(yàn)數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個(gè)母種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量注射劑< 10010%或4個(gè)（取較多者大體積注射劑（ 100ml100 v N< 500> 50010個(gè)2%或20個(gè)（取較少者2%或 10個(gè)（取較少者眼用及其他非注射產(chǎn)品< 200> 2005%或2個(gè)（取較多者10個(gè)桶裝固體原料< 44v N< 50> 50每個(gè)容器20%或4個(gè)容器（取較多者2%或 10個(gè)容器（取較多者醫(yī)療器

17、具10< 100100 v N< 500> 50010%或 4件 取較多者）10件2%或 20件 取較少者）注：若每個(gè)容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍表2上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑的最少檢驗(yàn)量供試品量V每支樣品接入每管培最少檢驗(yàn)數(shù)量(ml>養(yǎng)基的最少樣品量（瓶或支< 1全量201v Vv 5半量105< Vv 202ml1020< Vv 505ml1050< Vv 10010ml1050< Vv 100(靜脈給藥>半量10100< V< 500半量6V> 500500ml6每種培養(yǎng)基各接種10支供

18、試品.表3上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑的最少檢驗(yàn)量供試品裝量M母支樣品接入母呂培養(yǎng)最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支基的最少樣品量（瓶或支Mk 50mg全量2050mgc Mk 300mg半量10300mgC Mk 5g150mg10M> 5g500mg10一次性使用含藥產(chǎn)品整個(gè)產(chǎn)品10 每種培養(yǎng)基各接種10支供試品 桶裝固體原料的最少檢驗(yàn)數(shù)量為 4個(gè)包裝參考資料四：培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)應(yīng)注意培養(yǎng)條件：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基3035C 14天；改良馬丁培養(yǎng)基2328C 14天。選擇培養(yǎng)條件需考慮的因素：產(chǎn)品的性質(zhì)、 制造方法、潛在的微生物污染來(lái)源、可能遇到的微生物種類(lèi)。硫乙醇酸鹽 流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進(jìn)行分

19、裝、火菌。1、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酪胨（胰酶水解 15.0g、酵母浸出粉5.0g、葡萄糖5.0g、氯化鈉 2.5g、L-胱氨酸0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液1.0 ml、硫乙醇酸鈉 0.5g（或硫乙醇酸0.3ml、瓊脂0.75g、水1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.1 士 0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符 合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層 粉紅色）不超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/5 ，否則，須經(jīng)100 C

20、水浴加熱至粉紅色消失 不超過(guò)20分鐘），迅速冷卻， 只限加熱一次，并防止被污染。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置 30 C35C培養(yǎng)。2、改良馬丁培養(yǎng)基胨5.0g、磷酸氫二鉀1.0g、酵母浸出粉2.0g、硫酸鎂0.5g、葡萄 糖 20.0g、水 1000 ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值約為6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4 士 0.2 ,分裝，滅菌。改良馬丁培養(yǎng)基置23 C28C培養(yǎng)。3、選擇性培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培 養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗(yàn) 證實(shí)驗(yàn)。4、營(yíng)養(yǎng)肉湯

21、培養(yǎng)基胨 10.0g 、氯化鈉 5.0g 、牛肉浸出粉 3.0g 、水 1000 ml 取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH 為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié) pH值使滅菌后為7.2 士 0.2，分裝，滅菌。5、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 按上述營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法，加入 14.0g 瓊脂，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.2 士 0.2 ，分裝，滅菌。6、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，加入 14.0g 瓊脂，調(diào)節(jié) pH 值使滅 菌 后 為 6.4 士 0.2， 分 裝 ， 滅 菌 。參考資料五：培養(yǎng)基的適用性檢查1、無(wú)菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于 5支 <瓶)，培養(yǎng) 14天，應(yīng)

22、無(wú)菌生長(zhǎng)。2、靈敏度檢查菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代 <從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0代)，實(shí)驗(yàn)用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保 存技術(shù)進(jìn)行保存，以保證實(shí)驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus> CMCC(B> 26 003 銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa> CMCC(B> 10 104 枯草芽孢桿菌 <Bacillus subtilis) CMCC<)B63 501生孢梭菌 (Clostridium sporogenes> CMCC(B> 6

23、4 941 白色念珠菌 (Candida albicans> CMCC(F> 98 001 黑曲霉 (Aspergillus niger> CMCC(F> 98 0033、菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫 乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30C35C培養(yǎng)18小時(shí)24小時(shí)；接種白色念珠 菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2328 C培養(yǎng)2448小時(shí)，上述培養(yǎng)物用 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)小 于100cfu<菌落形成單位)的菌懸液。接

24、種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328 C培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05 % <v/v )聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶 液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含 0.05 % vv/v )聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu 的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28C可在24小時(shí) 內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28C,在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。4、培養(yǎng)基接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于 100cfu 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭

25、菌各 2 支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁 培養(yǎng)基5支,分別接種小于 100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各 2支，另1支不 接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng) 5天。逐日觀察結(jié)果。5、結(jié)果判定 空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈 敏度檢查符合規(guī)定。參考資料六：方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)1 、菌種及菌液制備除大腸埃希菌 <Escherichia coli )CMCC(B> 4 4102外，金黃色葡 萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度 檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。2、薄膜過(guò)濾法 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的

26、供試品總量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的實(shí)驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫乙 醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一 裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量實(shí)驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng) 3 5天，各實(shí)驗(yàn)菌同法操作。3、直接接種法取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于 100cfu 的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢 梭菌各 2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于 100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各 2管。其中 1管接入每支培養(yǎng)基 規(guī)定量的供試品量，另1管作為對(duì)

27、照，按置規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。4、結(jié)果判斷 與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的實(shí)驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則說(shuō)明供 試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)， 照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。如含供試品的任一容器 中的實(shí)驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn) 條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑 或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方 法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。參考資料七：供試品處理及接種培養(yǎng)基 直接接種法：每個(gè)供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培 養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用 量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。薄膜過(guò)濾法：將供試液混勻，過(guò)濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐 劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用 封閉式薄膜過(guò)濾器，分別將 100ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng) 基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如采用一般薄膜過(guò)濾器，取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含 50ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器 中，其中一份做陽(yáng)性對(duì)照用。薄膜過(guò)濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過(guò)濾器，也可使