術前化療對Ⅲ期NSCLC基因變異的作用及其臨床意義

1、    術前化療對期NSCLC基因變異的作用及其臨床 意義        摘要：目的通過檢測術前化療與單一手術組織標本之間多種癌基因與抑癌基因分子變異的差異，以期探討術前化療對期NSCLC患者基因變異的影響及其臨床意義。方法分別采用DNA印跡法及PCR技術，檢測75例期NSCLC組織DNA標本中c-myc、c-erbB2及EGFR多種癌基因擴增及71例組織中抑癌基因p15的純合性丟失。結果1)術前化療組的多種癌基因共擴增率為35.5%，而相應單一手術組為63.6%(

2、P0.05)。2)p15的純合性丟失率在術前化療組為23.3%，較單一手術組的70.7%有顯著性降低(P0.001)。結論術前化療對期NSCLC患者癌細胞具有攻擊及殺傷作用，從而不僅使癌基因的共擴增率下降，而且也使抑癌基因的丟失率降低。因此檢測基因的變化在一定程度上有可能作為術前化療對于期肺癌治療有效性的實驗室預測指標。關鍵詞：肺腫瘤/治療；藥物療法；外科手術；癌，非小細胞肺；癌基因；抑癌基因中分類號：R730.53文獻標識碼：A文章編號：1000-7431(2000)05-0385-03THE EFFECT OF PREOPERATIVE CHEMOTHERAPY ON GENES IN P

3、ATIENTS WITH STAGE NSCLC AND ITS CLINICAL IMPLICATIONSGU Ma-lin,ZHANG Hua, LIAO Mei-lin,et al.(Shanghai Cancer Insititute, Shanghai 200032,China)Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of preoperative chemotherapy on the alteration of oncogenes and tumor suppressor genes in locally advanced NSCL

4、C and its clinical significance.MethodsCo-amplification of oncogenes were evaluated by Southern blot and slot blot for 75 patients with stage NSCLC and homozygous deletion of MTS2/p15 gene was determined by PCR(Polymerase chain reaction) for 71 patients. Results1) The rate of co-amplification in sta

5、ge NSCLC patients with chemotherapy was 35.5%, while that in stage NSCLC without chemotherapy was 63.6%. 2) the rate of p15 gene homozygous deletion in group with chemotherapy (23.3%) was dramatically lower than in group without chemotherapy (70.7%,P0.001). ConclusionPreoperative chemotherapy plays

6、an important role in treatment of stage NSCLC patients. By attacking and killing the cancer cells, preoperative chemotherapy not only can lower the rate of oncogenes co-amplification, but also the rate of p15 gene homozygous deletion. Therefore, detection of genes alleration may be used as a potenti

7、al predictor for evaluating preoperative chemnotherapy in treatment of stage NSCLC patients.Key words：Lung neoplasms/treatment;Drug therapy；Surgical operation;Carcinoma,non-small-cell lung;Oncogenes;Tumor suppressor gene隨著環(huán)境的污染以及吸煙人群的增加，導致肺癌的發(fā)病率逐年增高并居上海市所有惡性腫瘤死亡率的首位，從而嚴重地危害人民的生命健康，因此肺癌的基礎及臨床研究日益受到人們

8、的密切關注及重視。NSCLC占肺癌80%以上，因此對于NSCLC的研究就更具有重要的臨床價值?；瘜W藥物早已被人們作為治療惡性腫瘤的主要手段之一，然而術前化療是近幾年剛開展的新綜合治療的一個組成部分。該治療方法的重要價值在于使腫瘤原發(fā)灶及其浸潤范圍縮小，為手術治療創(chuàng)造條件，提高手術切除率并有利于消除原發(fā)病灶以外的微小病灶，以減少術后播散及提高生存率，據(jù)報道NSCLC單一手術組的死亡危險是術前化療組的五倍1，2。林震瓊等3曾從病理形態(tài)學出發(fā)，分析術前化療對NSCLC的作用，結果發(fā)現(xiàn)期NSCLC患者作術前化療的手術標本約有23.8%可轉(zhuǎn)化為P期(病理分期)，從而提示通過術前化療可出現(xiàn)組織形態(tài)病理分級

9、降低的現(xiàn)象，但是否能出現(xiàn)癌基因及抑癌基因的變異至今尚未見報道。為此，本文擬從分子水平通過檢測術前化療組及非化療組NSCLC組織標本中多種癌基因(C-myc、C-erbB2及EGFR)活化及p15抑癌基因丟失之間的差異，以期探討術前化療對期NSCLC組織中基因的變異及其臨床應用意義。材料與方法一、組織標本19951998年期間收集經(jīng)病理證實的75例非小細胞肺癌新鮮手術標本其中31例患者術前經(jīng)化療處理，采用MVP方案(絲裂霉素、長春新堿、順鉑)23個周期。所有患者均屬上海市區(qū)居民并主要來自于上海市胸科醫(yī)院及上海市肺科醫(yī)院。新鮮組織標本均在手術切除后1 h內(nèi)放于液氮內(nèi)深低溫保存，以防組織自溶。二、D

10、NA純化DNA純化步驟基本參照Maniatis氏等分子克隆技術并結合本實驗室改良方法。三、基因檢測步驟采用DNA印跡法(Southern blot及slot blot)檢測每份非小細胞肺癌組織DNA中c-myc、c-erbB2及EGFR多種癌基因擴增；采用聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測抑癌基因p15的純合性丟失。四、基因探針及引物癌基因探針均由日本國家癌癥研究所基因庫饋贈，其中各類基因探針分子量c-erbB2為3.0 kb，c-myc為8.5 kb，EGFR為2.4 kb。PCR擴增時的引物：p15基因外顯子(Exon 2)及內(nèi)對照-actin基因的引物均由中科院細胞生物學研究所合成。p15基

11、因外顯子2(exon2)引物序列如下：sense 5-TGGCTCTGACCACTCTGC；antisense 5-AGCGAATTCGGGTGGGAAATTGGGGTAAGAA。-actin基因的引物序列如下：sense 5-GAAACTACCTTCAACTCCATC；antisense 5-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC五、資料統(tǒng)計處理采用2檢驗。結果一、期NSCLC中多種癌基因的共擴增對75例期NSCLC肺癌組織DNA標本采用DNA印跡法并分別以單個標本對C-myc、C-erbB2及EGFR基因同時作多基因擴增檢測(Coamplification of

12、 oncogenes)。判斷標準以三種癌基因中至少有兩個基因擴增作為陽性。實驗結果(見表1)表明術前化療后癌基因共擴增率為35.5 %，較單一手術組63.6 %低，且有統(tǒng)計學意義(P0.05)。二、期NSCLC與p15基因純合性丟失的相關性研究經(jīng)采用PCR法并結合p15基因外顯子2引物，分別對71例期NSCLC患者作基因純合性丟失檢測，以期了解p15基因失活在兩組標本中的差異。實驗結果(見表2)表明經(jīng)過術前化療p15基因純合性丟失率有顯著降低，且有統(tǒng)計學意義。 表1兩組期NSCLC多基因共擴增分組總例數(shù)c-myc、c-erbB2及EGFR共擴增陽性數(shù)陰性數(shù)陽性率(%)術前化療組31112035

13、.5單一手術組44271763.6?P0.05 表2兩組NSCLC中p15基因純合性丟失分組總例數(shù)p15基因純合性丟失陽性數(shù)陰性數(shù)陽性率(%)術前化療組3072323.3單一手術組41291270.7?P0.001 討論當今術前化療作為綜合治療的一個重要部分逐漸被人們所接受并成為一種發(fā)展趨勢，它能使原發(fā)病灶及其浸潤范圍縮小，為手術治療創(chuàng)造條件，進而可對期腫瘤患者采取包括外科手術在內(nèi)的多學科治療，從而能極大地改善患者的預后。關于化療后腫瘤組織分子遺傳學方面的變化也有報道，包括p53、p21及bcl-2的基因表達在頭頸癌輔助化療前后的變化等4，5。myc基因產(chǎn)物是一種能與DNA分子結合的蛋白質(zhì)，它

14、是一種轉(zhuǎn)錄活化因子(transcriptional activator)。在肺癌中myc基因活化的一般機制是基因擴增而導致的過度表達，一旦myc蛋白增加，可刺激細胞增生以最終惡變。臨床研究提示，幾乎所有的小細胞肺癌及大多數(shù)非小細胞肺癌組織中均可出現(xiàn)myc基因族中任何一種基因的變異，NSCLC中約有40%50%出現(xiàn)c-myc基因的基因擴增及高表達，這類患者預后差，生存期短6。c-erbB-2與EGFR均屬于表皮細胞生長因子受體，這類基因的過度表達在某些人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的惡性程度及癌癥患者低生存率之間存在密切的相關性。文獻報道腺癌中有83%出現(xiàn)上述基因的共擴增并與病人的不良預后有關7。

15、本實驗室曾對62例非小細胞肺癌新鮮組織標本進行c-myc、c-erbB2及EGFR三種基因擴增檢測，結果提示多種基因的共擴增率與病理分期呈正相關(P0.05)8。為此本文也采用上述方法檢測及分析經(jīng)術前化療或未化療的期NSCLC手術標本之間的分子變異，實驗結果表明術前化療后癌基因共擴增率為35.5%，較未化療組63.6%明顯降低并有統(tǒng)計學意義(P0.05)。這一結果充分說明術前化療對期NSCLC患者的癌細胞具有攻擊及殺傷作用，因此有效地降低了癌基因的共擴增率。1994年以來，p16、p15基因分別從人類染色體9p21-22區(qū)處分離及純化，并發(fā)現(xiàn)該基因?qū)貱DK4和CDK6(cyclin-depen

16、dent kinase)的抑制因子，稱為MTS1及MTS2。其基因表達產(chǎn)物可與CDK4-cyclin D復合物結合，使CDK4激活功能喪失，阻滯細胞進入G1/S期，抑制細胞過度生長。一旦p16，p15基因丟失或突變，失去對CDK功能的抑制從而促使細胞無限制地進入G1/S期并加快細胞分裂，最終導致細胞永生化而形成腫瘤細胞。Washimi等9證實非小細胞肺癌細胞株及原發(fā)性非小細胞肺癌組織均可出現(xiàn)p15及p16基因的純合性共丟失現(xiàn)象。本文采用PCR技術通過檢測p15基因純合性丟失比較研究術前化療及單一手術在期NSCLC中基因丟失情況，結果表明經(jīng)過術前化療p15基因純合性丟失率由未化療時的70.7%降

17、為23.3%。由此可見，本文進一步從分子水平證實了術前化療具有促使某些中晚期肺癌患者組織形態(tài)學惡性程度下降的作用。上述結果充分表明，術前化療對期NSCLC患者癌基因及抑癌基因的變異具有明顯的作用。通過術前化療殺傷癌細胞，既能使癌基因的共擴增率明顯下降，又能導致抑癌基因的純合性丟失率降低，因此有可能從分子水平上阻滯腫瘤細胞發(fā)展進程10。更為重要的是根據(jù)本文的初步結果可提示分子生物學研究有可能為期NSCLC患者采用術前化學藥物治療在臨床上的有效性提供實驗依據(jù)。至于對某些經(jīng)術前化療而導致分子生物學行為改變的期NSCLC患者的預后療效及生存率還有待于今后隨訪追蹤。(本文編輯：馬積慶)作者簡介：顧馬林，

18、男，大專，助理研究員。顧馬林（上海市腫瘤研究怕上海 200032）張華（上海市腫瘤研究怕上海 200032）廖美琳（上海市胸科醫(yī)院）趙明（上海市腫瘤研究怕上海 200032）周瑾（上海市腫瘤研究怕上海 200032）許凱黎（上海市腫瘤研究怕上海 200032）參考文獻1Rosell R, Comez-Codina J, Camps C, et al. A randomized rtrial comparing pre-operative chemotherapy plus surgery with surgery alone in patients with non-small cell lu

19、ng cancerJ. N Engl J Med,1994,330:1532Roth J, Fossella F, Komaki R, etal. A randomized trial comparing pre-operative chemotherapy and surgery with surgery alone in resectable stage A non-small cell lung cancerJ. J Natl Cancer Inst,1994,86:6733林震瓊.肺癌治療后的病理形態(tài)學M.見：廖美琳主編.肺癌現(xiàn)代治療M.第1版，上海：上海醫(yī)科大學出版社，1998：15

20、34Cabelguence A, Blons H, de Wazier I, et al. p53alterations predict tumor response to neoadjuvant chemotherapy in head and neck squamous cell carcinoma:a prospective seriesJ. J Clin Oncol,2000,18(7):14655Ashktorab H, Larbi D, Schwartz J, et al. Expression of p53, p21 and bcl-2 before and after trimetrexate based neoadjuvant chemotherapy for head and neck cancerC.The