水稻光溫敏核不育系的ISSR和SSR遺傳分析比較_圖文

1、研究報(bào)告RESEARCH REPOR T水稻光溫敏核不育系的ISSR 和SSR 遺傳分析比較李進(jìn)波2,3江良榮3李春海1牟同敏131華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢, 4300702湖北省農(nóng)科院雜交水稻工程技術(shù)研究中心, 武漢, 4300703海南省農(nóng)作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 三亞, 5720253通訊作者, tongmin public. wh. hb. cn 推薦人, 方宣鈞摘要本研究應(yīng)用ISSR 和SSR 技術(shù)建立了24個(gè)水稻光溫敏核不育系的DNA 指紋圖譜, 利用13個(gè)ISSR 引物和20對(duì)SSR 引物, 分別獲得174個(gè)多態(tài)性片段和62個(gè)多態(tài)性片段, 平均每個(gè)ISSR

2、引物檢測(cè)到13138個(gè)多態(tài)性片段, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SSR 引物的檢測(cè)率。根據(jù)遺傳距離進(jìn)行的聚類分析表明, 利用這兩種標(biāo)記所得的聚類結(jié)果十分相似, 24個(gè)材料被聚為粳型, 偏秈型和秈型三個(gè)類群, 在秈型不育系類群內(nèi), 又可明顯的分成三個(gè)亞類群, 其中7個(gè)安農(nóng)S -1衍生的不育系聚為一類, 與農(nóng)墾58S 衍生的不育系有明顯的遺傳差異。根據(jù)兩種標(biāo)記計(jì)算的遺傳距離及其遺傳關(guān)系, 所得的結(jié)果仍有一些差異, 但總體趨勢(shì)是一致。研究結(jié)果表明, ISSR 和SSR 標(biāo)記適用于構(gòu)建DNA 指紋圖譜, 進(jìn)行分類鑒定和遺傳分析。關(guān)鍵詞水稻, 光溫敏核不育系, ISSR , SSR , 遺傳分析Comparisons of

3、 G enetic Analysis Based on ISSR and SSR in P GMS and TGMS Rice LinesLi Jinbo 2,3Jiang Liangrong 3Li Chunhai 1Mou tongmin 131National K ey Laboratory of Crop G enetic Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan , 4300702Hybrid Rice Research and Development Center , Hubei Academy of Agricu

4、ltural Sciences , Wuhan , 4300703Hainan Provincial K ey Laboratory of Crop Molecular Breeding , Sanya , 5720253Corresponding author , tongmin public. wh. hb. cnCommunicated by Fang X. J.ABSTRACTIn this study , DNA fingerprints of 24elite photoperiod 2sensitive genic male sterile (P GMS and thermo 2s

5、ensitive genic male sterile (TGMS rice lines were established using inter 2simple sequence repeats (ISSR markers and simple sequence repeats (SSR markers. 13ISSR primers could amplify 174polymorphic bands and 20SSR primers could amplify 62polymorphic bands. The numbers of average polymorphic bands p

6、roduced by per ISSR primer are 13138more than those produced by per pair of SSR primer. The results showed that分子植物育種,2003年, 第1卷, 第1期, 第4247頁(yè)clustering analysis based on ISSR data is very similar to that based on SSR data. These 24sterile lines used in this research were divided into three groups ,

7、i ndica group , i ndica 2like and japonica group. In the i ndicagroup , 19sterile lines were also clustered into t hree sub groups. 7sterile lines derived f rom A nnon g S 21were clustered toget her , w hich show obviousl y genetic diff erences com pared to 11i ndica sterile lines derived fromNongke

8、n 58S. There are a little differences in genetic distance and genetic relationship of tested sterile lines cal 2culated by depending on data from ISSR or SSR. The results of this research demonstrated that it is more suit 2able for using ISSR and SSR as marker to do DNA fingerprint construction , cl

9、assification and genetic analysis.KEY WORDSRice , P GMS , TGMS , ISSR , SSR , G enetic analysis1前言兩系法培育雜交水稻是利用亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的主要育種途徑之一。自從1979年石明松發(fā)現(xiàn)湖北光敏感核不育水稻農(nóng)墾58S , 人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多新的水稻光、溫敏核不育資源, 如安農(nóng)S 21, 5460S 等, 并以這些原始不育材料為不育基因供體, 育成了各種不同類型的光、溫敏核不育系, 配制的兩系雜交稻組合已在全國(guó)大面積推廣應(yīng)用。目前, 全國(guó)已有30多個(gè)組合通過了省級(jí)和地市級(jí)品種審定委員會(huì)審定, 其中廣親和不

10、育系培矮64S 組配的兩系秈爪交組合培雜特青、培雜山青、兩優(yōu)培九等已在生產(chǎn)上大面積使用, 實(shí)現(xiàn)了亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的部分利用(盧興桂等, 2001 。目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用于生產(chǎn)的光、溫敏核不育系主要是來自于光敏感核不育水稻農(nóng)墾58S 和溫敏感核不育水稻安農(nóng)S 的衍生系, 這些不育系不僅在秈粳類型上和光溫敏特性上有差異, 而且在農(nóng)藝性狀的表現(xiàn)上也千差萬別。尤其是以農(nóng)墾58S 為不育基因供體, 在各種秈稻和粳稻材料中經(jīng)過廣泛轉(zhuǎn)育, 使得它們具有豐富的遺傳背景, 相互之間的親緣關(guān)系更為復(fù)雜, 很難從形態(tài)上和系譜來源上對(duì)他們進(jìn)行分類研究和遺傳分析。本研究采用的ISSR (inter 2simple sequenc

11、e re 2peats 和SSR (simple sequence repeats 標(biāo)記技術(shù), 都是基于PCR (polymerase chain reaction 技術(shù)的DNA 分子標(biāo)記技術(shù), 前者采用1722堿基的重復(fù)錨定引物擴(kuò)增重復(fù)序列之間的片段, 后者通過事先設(shè)計(jì)出成對(duì)的特異引物來擴(kuò)增重復(fù)序列單元。它們具有重復(fù)性好、穩(wěn)定程度高、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn), 已被廣泛用于品種鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳作圖等研究(Zietkiewicz et al. ,1994; 方宣鈞等, 2001; Akagi et al. , 1997 。利用這兩種標(biāo)記對(duì)水稻進(jìn)行遺傳分析和分類研究已有不少報(bào)道, 如利用ISS

12、R 標(biāo)記研究栽培稻和野生稻的親緣關(guān)系(何予卿等, 2001 , 分析中國(guó)疣粒野生稻的遺傳多樣性(錢韋等, 2000 , 對(duì)水稻光溫敏核不育系進(jìn)行分子鑒定和遺傳分析(李進(jìn)波等, 2002 , 利用SSR 標(biāo)記對(duì)兩系雜交稻的不育系和恢復(fù)系進(jìn)行分類研究(朱作峰, 2001 , 對(duì)雜交稻主要親本進(jìn)行遺傳差異研究(李云海等, 1999; 段世華, 2002 , 但同時(shí)利用這兩種標(biāo)記對(duì)水稻光溫敏核不育系的遺傳關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)性比較研究, 目前尚未見報(bào)道。本研究從已通過省級(jí)以上鑒定的不育系和近幾年參加全國(guó)不育系聯(lián)合鑒定的不育系中, 選取有代表性的17份來源農(nóng)墾58S 和7份來源安農(nóng)S 21的不育系, 共24份材

13、料為研究對(duì)象, 應(yīng)用ISSR 和SSR 兩種標(biāo)記技術(shù)對(duì)它們進(jìn)行研究, 旨在探討ISSR 和SSR 標(biāo)記建立DNA 指紋圖譜的可行性, 比較對(duì)水稻光、溫敏核不育系的遺傳多樣性分析和分類鑒定的實(shí)用性, 為不育系的選育和雜交組合的親本選配及育種家知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)提供分子依據(jù)。2材料與方法211試驗(yàn)材料供試的24個(gè)不育系(表1 , 均由育成單位提供。試驗(yàn)所用的生化試劑、酶及緩沖液購(gòu)自Promega 公司。ISSR 引物購(gòu)自加拿大British Columbia 大學(xué)。水稻SSR 引物根據(jù)http :/wanyu 2song. cn. hongnet. com/download/mblab/ricessr

14、. pdf 查得, 由上海生工合成。水稻光溫敏核不育系的ISSR 和SSR 遺傳分析比較Comparisons of G enetic Analysis Based on ISSR and SSR in PGMS and TGMS Rice Lines43表1供試的24個(gè)不育系材料Table 124sterile lines used in the study 編號(hào)code 不育系名稱names of sterile lines不育基因來源origin of sterile gene秈粳類型indica or japonica type光溫敏特性PGMS or TGMS育成單位release

15、of origin1農(nóng)墾58S農(nóng)墾58S 粳光敏湖北仙桃農(nóng)科所27001S 農(nóng)墾58S 粳光敏安徽農(nóng)科院3N5088S農(nóng)墾58S 粳光敏湖北農(nóng)科院4培矮64S農(nóng)墾58S 偏秈溫敏湖南雜優(yōu)中心5HN5S 農(nóng)墾58S 偏秈溫敏湖北農(nóng)學(xué)院6K1405S 農(nóng)墾58S 秈溫敏廣西農(nóng)科院7N17S 農(nóng)墾58S 秈光敏華南農(nóng)業(yè)大學(xué)8W6111S 農(nóng)墾58S 秈溫敏湖北農(nóng)科院9W7415S 農(nóng)墾58S 秈光敏湖北農(nóng)科院10W9593S 農(nóng)墾58S 秈光敏湖北農(nóng)科院11N23S 農(nóng)墾58S 秈光敏華南農(nóng)業(yè)大學(xué)12N9S農(nóng)墾58S 秈光敏華南農(nóng)業(yè)大學(xué)13蘇紫S農(nóng)墾58S 秈溫敏揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院14G D 2IS農(nóng)墾

16、58S 秈溫敏廣東農(nóng)科院15中紫S農(nóng)墾58S 秈溫敏中國(guó)水稻所16G D 22S農(nóng)墾58S 秈溫敏廣東農(nóng)科院17蜀光612S農(nóng)墾58S 秈溫敏四川農(nóng)業(yè)大學(xué)18F131S 安農(nóng)S 21秈溫敏江西贛州水稻所197075S安農(nóng)S 21秈溫敏江西農(nóng)科院20安湘S 安農(nóng)S 21秈溫敏湖南雜優(yōu)中心21香125S 安農(nóng)S 21秈溫敏湖南雜優(yōu)中心22湘早22S安農(nóng)S 21秈溫敏湖南雜優(yōu)中心23810S 安農(nóng)S 21秈溫敏湖南安江農(nóng)校241290S安農(nóng)S 21秈溫敏江西農(nóng)科院212基因組DNA 的提取將水稻種子浸種、催芽后種于培養(yǎng)缽中, 一周后剪取幼苗葉片, 按修改后的CTAB 法提取基因組DNA (方宣鈞等,

17、 1997 。213PCR 擴(kuò)增和電泳檢測(cè)ISSR -PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同文獻(xiàn)(李進(jìn)波等, 2002 , SSR -PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序以及聚丙烯酰胺凝膠電泳和快速銀染檢測(cè)參照文獻(xiàn)(李進(jìn)波等, 2002 進(jìn)行。PCR 反應(yīng)在美國(guó)MJ Research , Inc. 生產(chǎn)的PTC 2100TMPCR 儀中進(jìn)行。214數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析將ISSR 和SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段, 分別用1和0記錄DNA 片段的有無, 利用CL UST 分析軟件, 計(jì)算遺傳距離D (D =-ln2M xy /(M x +M y ,M x 和M y 分別為X 和Y 兩材料的總片段數(shù), M xy 為共享片段數(shù) , 用U

18、 P GMA 法進(jìn)行聚類分析, 繪制樹形圖。3結(jié)果與討論311ISSR 和SSR 指紋圖譜的建立利用篩選到的13個(gè)ISSR 引物和20對(duì)SSR 引物分別對(duì)供試材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 建立了相應(yīng)的DNA 指紋圖譜(圖1、圖2 。從表2中可以看出,44分子植物育種Molecular Plant BreedingISSR 能揭示DNA 多態(tài)性的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SSR 。通過指紋圖譜比較發(fā)現(xiàn), 無論是ISSR 指紋圖譜還是SSR 指紋圖譜, 任何兩個(gè)不育系間都沒有完全相同的帶型, 通過比較DNA 指紋能將供試的24個(gè)不育系一一區(qū)分 。表2ISSR 2PCR 和SSR 2PCR 的擴(kuò)增結(jié)果比較Table 2

19、Comparison of the results amplified by ISSR and SSR 項(xiàng)目itemsISSRSSR引物數(shù)量number of primers1320多態(tài)性片段總數(shù)polymorphic fragments17462平均每個(gè)(對(duì) 引物的多態(tài)性片段數(shù)polymorphic fragments per primer131383110片段大小(bp size of fragment200-300085-262圖1ISSR 引物UBC890的擴(kuò)增結(jié)果例子Figure 1The examples of banding patterns amplified by ISSR

20、Primer UBC 890圖2SSR 引物RM125(上 和RM286(下 的擴(kuò)增結(jié)果例子Figure 2The examples of banding patterns amplified by SSR primers RM125(above and RM286(below 312水稻光、溫敏核不育系的ISSR 和SSR遺傳分析根據(jù)遺傳距離進(jìn)行聚類分析, 從繪制的樹形圖(圖3、圖4 可看出, 利用這兩種標(biāo)記得到的聚類分析結(jié)果十分相似。供試的24份材料可明顯地分成粳、偏秈、秈三個(gè)類群, 在秈稻類群內(nèi), 又分為三個(gè)亞類群, 其中7個(gè)安農(nóng)S 21衍生的不育系自聚為一類, 可與農(nóng)墾58S 衍生的不

21、育系加以區(qū)分。遺傳分析結(jié)果表明, 秈粳類型上存在的遺傳差異表現(xiàn)出親緣關(guān)系的差異是最主要的。在秈型不育系類群中, 不育基因來源不同也表現(xiàn)出明顯的遺傳差異, 安農(nóng)S 21衍生的秈型不育系與農(nóng)墾58S 衍生的秈型不育系各自形成不同的亞類群。安農(nóng)S 21衍生的秈型不育系相互之間遺傳差異相對(duì)較小, 這與安農(nóng)S 21主要在早秈稻中進(jìn)行轉(zhuǎn)育水稻光溫敏核不育系的ISSR 和SSR 遺傳分析比較Comparisons of G enetic Analysis Based on ISSR and SSR in PGMS and TGMS Rice Lines45有關(guān); 而農(nóng)墾58S 衍生的秈型不育系, 具有更豐富

22、的遺傳多樣性, 可能這與農(nóng)墾58S 由粳型經(jīng)秈粳雜交轉(zhuǎn)育成秈型不育系時(shí), 所用親本范圍較廣密切相關(guān)。這也正是以農(nóng)墾58S 衍生的不育系配制的雜交組合在我國(guó)已經(jīng)投入商品化種子生產(chǎn)的兩系雜交稻組合中占絕大多數(shù)的主要原因 。圖324個(gè)不育系ISSR 標(biāo)記的U PGMA 樹形圖Figuer 3Dendrogram of 24sterile lines based on ISSR data using U PGMA method and Nei distance圖424個(gè)不育系SSR 標(biāo)記的U PGMA 樹形圖Figure 4Dendrogram of 24sterile lines based on

23、SSR data using U PGMA method and Nei s distance313ISSR 和SSR 用于分析水稻光溫敏核不育系遺傳差異的比較應(yīng)用ISSR 和SSR 兩種標(biāo)記所獲得的結(jié)果, 總體上是一致的, 但在具體的遺傳距離和少數(shù)不育系的遺傳關(guān)系上略有差異。在SSR 分析中, 秈粳兩大類群之間以遺傳距離014947為分界線, 24個(gè)不育系之間的遺傳距離在010213-019163之間, 而在ISSR 分析中, 秈粳兩大類群之間以遺傳距離015618為分界線, 24個(gè)不育系之間的遺傳距離在010256-111757之間。蜀光612S 在ISSR 分析中與K1405S 、N17

24、S 、W6111S 、N23S 和中紫S 聚為一類, 而在SSR 分析中介于秈型類群與偏秈型類群之間。對(duì)于粳型不育系7001S 和N5088S , 都是以農(nóng)墾58S 為母本, 以中粳品種為父本, 經(jīng)一次雜交多代選育而成, 用ISSR 分析時(shí), 7001S 與農(nóng)墾58S 之間的遺傳距離大于N5088S 與農(nóng)墾58S 之間的遺傳距離, 而用SSR 分析時(shí), N5088S與農(nóng)墾58S 之間遺傳距離大于7001S 與農(nóng)墾58S之間遺傳距離。產(chǎn)生這些差別的主要原因可能有兩方面:一是ISSR 標(biāo)記和SSR 標(biāo)記所檢測(cè)的基因座位不同, 因?yàn)镾SR 標(biāo)記檢測(cè)的是重復(fù)序列, 而ISSR 標(biāo)記檢測(cè)到的是重復(fù)序列間

25、片段; 二是與所選擇的引物有關(guān), 因?yàn)椴煌囊餀z測(cè)到的多態(tài)性是不一樣的, 而且多態(tài)性片段數(shù)隨引物數(shù)量的增加而增加, 必然引起遺傳距離的變化。ISSR 和SSR 標(biāo)記是基于PCR 技術(shù)的DNA 分子標(biāo)記, 與RFL P 、AFL P 等分子標(biāo)記相比, 省去了酶切、放射自顯影等繁瑣過程, 操作相對(duì)簡(jiǎn)單, 對(duì)DNA 質(zhì)量和數(shù)量的要求也較低。ISSR 標(biāo)記結(jié)合了RAPD 和SSR 標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn), 使用比RAPD 引物更長(zhǎng)的引物, 克服了RAPD 標(biāo)記穩(wěn)定性和重復(fù)性差等缺點(diǎn); SSR 標(biāo)記雖然在引物開發(fā)階段需投入大量人力、財(cái)力, 但引物開發(fā)一旦成功, 只需利用商品化的SSR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 即可

26、獲得豐富的DNA 多態(tài)性。本研究應(yīng)用ISSR 和SSR 標(biāo)記對(duì)水稻光溫敏核不育系進(jìn)行的遺傳分析結(jié)果基本相同, 不僅能揭示供試材料秈、粳亞種之間的46分子植物育種Molecular Plant Breeding水稻光溫敏核不育系的 ISSR 和 SSR 遺傳分析比較 47 Comparisons of Genetic Analysis Based on ISSR and SSR in P GMS and T GMS Rice Lines 遺傳差異 , 而且能檢測(cè)出偏秈型不育系與其它不 育系之間的遺傳差異 , 在秈型不育系中 , 還能根 據(jù)不育基因來源的不同確定各材料之間的親緣關(guān) 系 。兩種分子標(biāo)

27、記比較而言 , 由于 ISSR 標(biāo)記能檢 測(cè)出更多的 DNA 多態(tài)性 , 而且一套 ISSR 引物可 在多種作物中通用 , 提高了其利用率 , 因此在遺 傳關(guān)系研究方面 , ISSR 標(biāo)記具有更廣闊的應(yīng)用前 景。 段世華 , 毛加寧 , 朱英國(guó) , 用微衛(wèi)星 DNA 標(biāo)記對(duì)我國(guó)雜交 水稻主 要 恢 復(fù) 系 遺 傳 差 異 得 檢 測(cè) 分 析 , 遺 傳 學(xué) 報(bào) , 2002 , 29 ( 3 , 250 - 254 DNA 應(yīng)用于 RAPD2PCR 擴(kuò)增 , 高技術(shù)通訊 , 1997 , 7 ( 10 , 40 - 43 ISSR 分子標(biāo)記研究栽培稻和野生稻親緣關(guān)系 , 農(nóng)業(yè)生 ISSR 標(biāo)記

28、鑒定及遺傳分析 , 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) , 2002 , 18 ( 1 , 6 - 9 ( 7 , 741 - 750 方宣 鈞 , 孔 巍 , 金 蕪 軍 , 快 速 一 步 法 ( ROSE 法 提 取 方宣鈞 , 吳為人 , 唐紀(jì)良 , 作物 DNA 標(biāo)記輔助育種 , 科 學(xué)出版社 , 2001 何予 卿 , 張宇 , 孫梅 , 何光存 , 王 松 文 , 朱 英 國(guó) , 利 用 致謝 在此作者非常感謝海南省熱帶農(nóng)業(yè)資源研究 所所長(zhǎng)方宣鈞博士對(duì)本研究工作的具體指導(dǎo)和論 文手稿的認(rèn)真審閱 ; 感謝海南省農(nóng)作物分子育種 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供科研條件和經(jīng)費(fèi)支持 。本研究由 國(guó)家 863 計(jì)劃 ( 批準(zhǔn)號(hào) : 2001AA211091 、海南 省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 ( 批準(zhǔn)號(hào) : 3003 及 2001 年 海南省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目資助 。 李進(jìn)波 , 牟同敏 , 方宣鈞 , 12 個(gè)水稻光溫敏核不育系的 李進(jìn)波 , 牟同