提高農(nóng)桿菌介導T-DNA轉(zhuǎn)入大豆子葉節(jié)點細胞的研究

1、L-半胱氨酸提高農(nóng)桿菌介導T-DNA轉(zhuǎn)入大豆子葉節(jié)點細胞的研究摘要:主要難點在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大豆大豆(L美林是利用農(nóng)桿菌介導法,用子葉節(jié)點方法將低頻的T-DNA 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到子葉節(jié)點細胞中去。我們可使農(nóng)桿菌感染率增加,從37%到91%來自于子葉植節(jié)點修改過的共培養(yǎng)地區(qū)中,連同半胱氨酸,可使增加了五倍的T-DNA轉(zhuǎn)移到新興芽原基。南部分析檢測比前一個轉(zhuǎn)換效率提高一倍,測定其獨立肥沃的數(shù)目,轉(zhuǎn)基因植物的接種。組織酶可使褐變外植體減少,這表明半胱氨酸可對帶有傷口和致病防御反應的大豆有侵染性、導致T-DNA增加傳遞到子葉節(jié)點細胞中。關(guān)鍵詞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆;酶促;褐變傷口和致病防御反應藥品:BaP:6-芐-

2、葡聚糖赤霉素;GA3:赤霉素;IAA:吲哚乙酸;MES:乙烷磺酸鈉鹽;NAA:萘乙酸;PPT:氧磷基1988年Cristou等人使用各種方法轉(zhuǎn)化菌液。然而,大豆的轉(zhuǎn)化仍非常困難。子葉節(jié)點(嬰兒床節(jié)點方法是一種常用的大豆轉(zhuǎn)化體系,將農(nóng)桿菌介導的T-DNA運送到細胞使其再生,在子葉的莖尖處腋窩淋巴結(jié)。但這一轉(zhuǎn)化效率仍然很低, 很顯然,只有很少的T-DNA交付在子葉的莖尖腋窩淋巴結(jié)上,所以轉(zhuǎn)基因細胞轉(zhuǎn)化效率低,轉(zhuǎn)基因植株再生率低。據(jù)報道,現(xiàn)在已經(jīng)改進了子葉節(jié)點轉(zhuǎn)換系統(tǒng)。例如,改進選擇性和再生植株的生長。Bolton等人經(jīng)過不斷的努力,用提高農(nóng)桿菌的致病性來增加化學試劑的誘導基因改善虛擬基因構(gòu)造。大豆

3、品種篩選和鑒定,Bidney等人用顯微投像攻擊法或者降解法來增加植物的感染率。可是這些研究方法,顯然對改善的子葉節(jié)點系統(tǒng)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大豆植株并沒有起到很好的效果。在大豆子葉節(jié)點轉(zhuǎn)化體系中,靶位細胞轉(zhuǎn)化,是將5天時間生長出來的子葉,沿著胚軸將其切開,將上胚軸切除,用解剖刀在子葉的節(jié)點處制造傷口,但不能超過子葉節(jié)點處。下面介紹農(nóng)桿菌介導的方法,當研究子葉節(jié)點轉(zhuǎn)化系統(tǒng)時,我們注意到,在培養(yǎng)時大豆子葉的傷口處,出現(xiàn)了酶促褐變褐組織壞死。大豆子葉是非常容易被病菌感染的,例如Boué等人在2000年發(fā)現(xiàn)植物抗生素合成可以引起真菌的出現(xiàn)。在觀察大豆子葉褐變時,我們可以假定,大豆子葉傷口的感染可能激活

4、致病防御反應,這就制約了農(nóng)桿菌介導的T-DNA轉(zhuǎn)移到子葉節(jié)點細胞中去。在其它植物體中試圖降低褐變和組織壞死的發(fā)生,在農(nóng)桿菌介導方法中已有報道,但不是在大豆中,二硫抗氧劑、聚乙烯可以提高農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化效率。而半胱氨酸,維生素可以減少組織壞死,用于莖尖農(nóng)桿菌介導時,Perl鋁等人在固體共培養(yǎng)基中加入了葡萄糖等有機物質(zhì)。由于低下的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率制約了轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn),我們重點時改善,將T-DNA 轉(zhuǎn)移到子葉節(jié)點細胞中的方法。在研究調(diào)查過程中,我們注意到,在固體培養(yǎng)基中添加L-半胱氨酸,可使農(nóng)桿菌中更多的T-DNA轉(zhuǎn)移到外植體子葉節(jié)點中,從而擴大培養(yǎng)了的轉(zhuǎn)基因大豆植株。材料和方法農(nóng)桿菌菌株AGL(H

5、ellens and Mullineaux 2000被轉(zhuǎn)化成一個二進制轉(zhuǎn)化質(zhì)粒bsf16,其中包括抗除草劑自由基因型的bar基因和表現(xiàn)型gus基因。把它們轉(zhuǎn)化到葡萄苷酸酶中,gus基因僅在植物體的序列中表現(xiàn)而不在細菌的序列中表現(xiàn)。CaMV35S基因是由gusA基因和bsf16一起促進構(gòu)成的。農(nóng)桿菌的制備農(nóng)桿菌的制備和子葉節(jié)點方法是,農(nóng)桿菌AGL1首先被應用于YEP的固體培養(yǎng)基中。 pbsf16質(zhì)粒上的T-DNA結(jié)構(gòu),從右向左一次為RB,OCS羧合酶,BarPPT基因,P35S CaMV 35S生長基因,PVic生長基因,Ssa向日葵清蛋白基因,TVic基因,gusA基因。GUS基因的使用,(蛋

6、白胨10 g/ L,氯化鈉5 g/ L,酵母提取物5 g/L,瓊脂1.5 g/L, pH=7.0以及利福平5 g/L、四環(huán)素5 g/L、在25 下培養(yǎng)2天,用50 ml的YEP和含有抗生素的培養(yǎng)基,將一個單個群體接種上面,并在25 下振蕩培養(yǎng)兩天直到飽和。接種的前一天,用3 ml的YEP添加到200 ml的液體YEP,并加入適當抗生素,培養(yǎng)生長溫度控制在25 ,直到OD650達到0.8-1.0 。在接種前,取50 ml培養(yǎng)液放入到離心機中,以3270 r/min,離心10 min。使細菌形成一個小的顆粒狀為止,將懸浮的細菌放入到含有10%的B5大量、MS鐵鹽、3%蔗糖、20 mlMES、pH=

7、5.4、B5有機、20微升N-乙酰甲基氨、1.67 ml/L BAP、0.25 ml/L GA3的培養(yǎng)基中。外植體的制備大豆種子大豆(L美林使用氯氣滅菌,滅菌后的種子被接種在B5培養(yǎng)基上(B5大量、B5有機、MS鐵鹽、2%蔗糖、0.8瓊脂、pH=5.8 ,3個培養(yǎng)皿一組,將其包裹后放入培養(yǎng)室內(nèi),平均溫度250C左右,光照強度(90 E/m2s150 E/m2s,光照時間18 h /6 h(光/暗,生長周期為5天-7天,或者直到種子發(fā)芽,但一定要在長出第一片葉子之前進行下一步操作。農(nóng)桿菌那感染每株秧苗根據(jù)Hinchee等人的方法,在子葉節(jié)點以下用解剖刀可以將大多數(shù)的根部和胚軸切除3 mm-5 m

8、m左右。用解剖刀垂直切開子葉下胚軸的地方,可以獲得兩個被分開的大豆子葉。隨后將上胚軸切除,并將腋生胚芽和子葉節(jié)點處劃傷,用解剖刀垂直下胚軸劃10刀左右。將大豆子葉接種到25ml含有農(nóng)桿菌的懸浮液中。30分鐘后,5個一組隨意擺放到直徑為100x15已滅菌過的培養(yǎng)皿里的濾紙上,并在上面倒一層含濃度為0.5%的瓊脂培養(yǎng)基,25 0C下,暗培養(yǎng)5天。GUS的染色、選拔和植株再生5天后,對大豆子葉進行清洗并接種到新的培養(yǎng)基上( B5大量、MS鐵鹽、3%蔗糖、3 mlMES、pH=5.6、B5有機、1.67 mg/L BAP、100 ml/L 頭飽霉素、500 ml/l ticarcillin 接種前要洗

9、去多余的農(nóng)桿菌。把7個或10個大豆子葉放到一起處理,用( 80 mlNa2HPO4/、8 mlNa2EDTA、0.8%Triton-X、1.6%二甲基化亞礬、20%甲醇、0.38%K4Fe(CN6、1mlX-glucarochasalt、pH=8.0 ,處理后,在37 0C下放置2天,然后將大豆子葉用75%的酒精清洗。選擇轉(zhuǎn)芽、接種到誘導叢生芽的固體培養(yǎng)基中(0.8%瓊脂含PPT的濃度在(1.33 ml/l、3.33 ml/l、或5.0 ml/l。培養(yǎng)溫度在24 0C,光照強度(90 E/m2s150 E/m2s,光照時間18 h/6 h(光/暗。培養(yǎng)14天后,仔細切除上胚軸,然后轉(zhuǎn)到新的發(fā)芽

10、培養(yǎng)基中進行次代培養(yǎng),并放回培養(yǎng)室內(nèi),再培養(yǎng)14天。子葉被切除后,愈傷組織需培養(yǎng)28天。然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移芽伸長培養(yǎng)基中(MS鐵鹽、3%蔗糖、3 mlMES、0.8%的瓊脂、pH=5.6、B5有機、0.1 ml/L IAA、0.5 ml/L GA3、1 ml/L玉米素、100 mg/L焦谷氨酸、50 mg/L天冬酰氨酸、1.0 mg/L cefotaxime、1.3 mg/L5 mg/L PPT 。這時,一部分大豆子葉用半胱氨酸處理,并將Gus基因著色,切除大約5 mm進行分析,芽伸長后接種倒生根培養(yǎng)基中( MS大量、MS鐵鹽、2%蔗糖、3 mlMES、0.8%瓊脂、pH=5.8、B5有機、5

11、0 mg/L天冬酰氨酸、100 mg/L焦谷氨酸、0.5ml/L NAA 。將T0和T1代放入培養(yǎng)室進行培養(yǎng)、16 h/8 h(光/暗,用1000 W日光燈下進行自然光照。Southern印跡分析依照Sambrook等人的方法提取總DNA。用限至酶EcoRI酶切10ml完整DNA片斷,酶切后的DNA在0.8%瓊脂糖膠上分離,Southern雜交是依照Sambrook的方法進行的。DNA的轉(zhuǎn)膜、雜交、洗胱可依照Milipore試驗手冊進行,用限至酶SphI酶切pBSF16質(zhì)粒載體,產(chǎn)生1.8 kb的片斷作為指針,該片斷包含gusA編碼,片斷在1.2%瓊脂糖膠上分離,用酚-氯仿法純化提取,利用PedPrimen隨機引物標記系統(tǒng)。在STORM#840中過夜放射投影。試驗設(shè)計及統(tǒng)計分析轉(zhuǎn)化后5天的大豆子葉隨機抽取放置到固體培養(yǎng)基上,包括11個半胱氨酸處理。實驗設(shè)計是包含7次重復的隨機,但實驗平均計算根據(jù)兩個評價系統(tǒng)而來,每個系統(tǒng)又包括兩套獨立的計算。對數(shù)據(jù)做方法分析,對每個試驗分別計算、處理、評價以及評價的影響。每個試驗中心的平均數(shù)和LSD也分別計算。結(jié)果與討論為了研究L-半胱氨酸對農(nóng)桿菌介導T-DNA到大豆子葉節(jié)點細胞的轉(zhuǎn)移,我們采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染瞬時表達