微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用

1、微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用                   作者：陳銀生，莊明華，姜蘇明微透析技術(shù)是將推挽灌流和透析技術(shù)結(jié)合起來(lái)并逐漸完善的一種新型生物采樣技術(shù),可在麻醉或清醒的生物體上使用,特別適合于深部組織和重要器官的活體生化研究。微透析技術(shù)最早應(yīng)用于腦內(nèi)是在1972年美國(guó)耶魯大學(xué)報(bào)道的猴腦的微透析研究，之后微透析即開(kāi)始應(yīng)用于對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的改變，藥物動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)以及一些疾病腦內(nèi)神經(jīng)生理改變的研究，至今已有

2、30多年的歷史。本文就微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用作一綜述。1  微透析技術(shù)的原理及探針回收率的測(cè)定    微透析技術(shù)是以透析原理作為基礎(chǔ)的在體取樣技術(shù)，是在非平衡條件下即流出的透析液中待測(cè)化合物的濃度低于它在探針膜周圍樣品基質(zhì)中的濃度，灌注埋在組織中的微透析探針，組織中的待測(cè)化合物沿濃度梯度擴(kuò)散進(jìn)入透析液，被連續(xù)不斷地帶出，從而達(dá)到從活體組織中取樣的目的，通過(guò)測(cè)定流出液即透析液中待測(cè)物的濃度來(lái)研究組織中待測(cè)物的水平。這是一種動(dòng)態(tài)連續(xù)的取樣方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，微透析技術(shù)的原理就相當(dāng)于在組織中創(chuàng)造了一個(gè)“毛細(xì)血管”，使化合物在濃度差的作用下擴(kuò)散而進(jìn)入此“毛細(xì)

3、血管”，然后隨液體流動(dòng)帶出體外進(jìn)行檢測(cè)。    微透析技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是可在基本上不干擾體內(nèi)正常生理過(guò)程的情況下進(jìn)行在體、實(shí)時(shí)和在線取樣,透析過(guò)程探針周圍的組織液成分不會(huì)發(fā)生改變，所以可以持續(xù)收集樣品，而且被透析動(dòng)物可以小到老鼠一般大小。通過(guò)微透析技術(shù)可以單獨(dú)取得細(xì)胞外液,因此可對(duì)大腦神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行活體監(jiān)測(cè)1，由于透析液中不含蛋白質(zhì)和酶等生物大分子，能直接進(jìn)樣進(jìn)行高效液相和毛細(xì)管電泳等生化分析，免除了復(fù)雜的進(jìn)樣前樣品處理及由此而產(chǎn)生的樣品損失和誤差，也不會(huì)因在室溫取樣而酶解，提高了樣品的穩(wěn)定性，而且隨著現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)步可以對(duì)微透析試驗(yàn)進(jìn)行全程的自動(dòng)化控制。 &

4、#160;  微透析試驗(yàn)中一個(gè)重要的步驟是要測(cè)定微透析探針的回收率(透析液中待測(cè)化合物的濃度與其在樣品基質(zhì)中濃度之比)，由于微透析是在非平衡條件下取樣，所以所測(cè)得的透析液中化合物的濃度只是探針周圍樣品基質(zhì)中該化合物濃度的一部分。在了解該化合物待測(cè)部位的實(shí)際濃度時(shí)必須測(cè)定探針的回收率，它是影響微透析結(jié)果的重要因素，并取決于取樣部位的生物學(xué)性質(zhì)、透析膜的物理性質(zhì)(材料，孔徑，長(zhǎng)度，幾何形狀等)、待測(cè)物質(zhì)的分子量、灌流速度、壓力、生物體本身的健康條件和生物節(jié)律等2。    探針回收率有體內(nèi)、體外之分，體外的測(cè)定方法比較簡(jiǎn)單，配制被測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行透析，測(cè)定

5、透析液中該物質(zhì)的濃度，再與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行比較即可得出。體內(nèi)的測(cè)定則較復(fù)雜，常用的體內(nèi)測(cè)定方法零凈通量法，該法是將灌流液流速控制恒定,分別測(cè)定不同濃度的灌流液達(dá)到穩(wěn)態(tài)后透析液中分析物的濃度。當(dāng)灌流液中分析物的濃度低于探針外介質(zhì)時(shí)，擴(kuò)散方向就是從介質(zhì)到探針；反之，即是從探針到介質(zhì)。零通量點(diǎn)時(shí)，探針內(nèi)外濃度相等。繪制灌流液不同濃度與透析液中分析物濃度的直線回歸圖，這時(shí)斜率即為探針回收率3，5。此法是一種帶有嘗試性的方法，需要對(duì)分析物在體內(nèi)的濃度范圍有一定的了解。反透析法是用一種內(nèi)標(biāo)物加入到灌流液中進(jìn)行透析，通過(guò)測(cè)定透析液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，與灌流液濃度做對(duì)比，用1減去該比值即為該物質(zhì)的體內(nèi)回收率4，5

6、。這種內(nèi)標(biāo)物要求具有惰性，不與體內(nèi)物質(zhì)反應(yīng)且又盡可能與待測(cè)物結(jié)構(gòu)性質(zhì)相近。該法優(yōu)點(diǎn)在于可真實(shí)反映體內(nèi)回收率的變化情況。低速灌流法2，3，在灌流速度約為50nL/min時(shí)進(jìn)行灌流，一般相對(duì)回收率可達(dá)90%。這種方法的缺點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的，不但在樣本采集時(shí)耗時(shí)，且在灌流過(guò)程中樣品揮發(fā)程度也很嚴(yán)重。    在只需要知道被測(cè)物質(zhì)的相對(duì)濃度變化時(shí)，可簡(jiǎn)單的測(cè)定探針的體外回收率，測(cè)定應(yīng)在透析前進(jìn)行，配制被測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度要與該物質(zhì)在體內(nèi)的濃度相似)，用與體內(nèi)試驗(yàn)相同的灌流速度灌流探針，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后收集透析液并進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定濃度與標(biāo)準(zhǔn)液濃度之比就是探針的體外回收率。此法雖簡(jiǎn)

7、單易行，但由于被測(cè)物質(zhì)在體內(nèi)、外的狀況不同，檢測(cè)結(jié)果不能嚴(yán)格的等同于體內(nèi)回收率。2  微透析系統(tǒng)的組成及腦內(nèi)微透析的操作步驟   目前國(guó)際上生產(chǎn)微透析系統(tǒng)的公司主要有：瑞典CMA公司，美國(guó)BAS公司，以及日本的EICOM公司，我們使用的是美國(guó)BAS公司的產(chǎn)品。中國(guó)科學(xué)院北京化學(xué)研究所6，中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所，天津神經(jīng)外科研究所都較早地開(kāi)展了微透析技術(shù)，而且可以自行設(shè)計(jì)微透析探針并申請(qǐng)了國(guó)家專利7。    微透析系統(tǒng)主要有：微量灌注泵，與微量灌注泵相配套的微量注射器，連接管，微透析探針，與探針相配套的微透析套管以及微透析分

8、段收集儀。另外在透析清醒大鼠時(shí)還需要一套光感應(yīng)收集籠以保證大鼠在透析過(guò)程中可以自由活動(dòng)而不影響透析過(guò)程。其中最關(guān)鍵的部分是微透析探針，它是由導(dǎo)入管,導(dǎo)出管,中空纖維管,半透膜組成。BAS公司有3種不同設(shè)計(jì)風(fēng)格的探針(針式、直線型、分流型)。該公司提供的可選擇探針有腦探針,主要用于腦組織及脊髓組織的透析；聯(lián)合灌注腦探針主要用于腦組織，可以同時(shí)進(jìn)行透析和灌注；脈管探針主要用于血管、肌肉、皮下組織、腹膜等組織部位的透析；線型探針主要用于真皮、肌肉、肝臟、胰腺、腎臟等部位的透析；環(huán)型探針主要用于皮下組織,分流型探針主要用于檢測(cè)膽汁成分的變化。另外依據(jù)探針的形狀又可將其分為U型、I型、線性和環(huán)形探針8，

9、其中U型、I型探針由于其體積小，對(duì)腦組織損傷小常用于腦內(nèi)微透析，而線型、環(huán)型探針的使用同上所述。每種探針都有幾種不同長(zhǎng)度的半透膜供選擇。試驗(yàn)中探針的選擇主要依據(jù)所透析的部位以及靶組織的尺寸，不必完全拘泥于探針的設(shè)計(jì)風(fēng)格。    對(duì)于腦內(nèi)的透析試驗(yàn)，為防止探針膜的損傷，在試驗(yàn)前應(yīng)先在麻醉狀態(tài)下，給大鼠腦部植入微透析探針引導(dǎo)管,依照大鼠腦立體定位圖譜，借助立體定位儀找到目標(biāo)部位植入微透析探針引導(dǎo)管，手術(shù)后34d大鼠恢復(fù)自由活動(dòng)后開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行透析，試驗(yàn)時(shí)先將微透析系統(tǒng)連接好，沖洗探針(探針膜被甘油封存著，使用前應(yīng)先將其沖洗掉)，探針準(zhǔn)備好后，拔出大鼠腦部引導(dǎo)管內(nèi)芯將微透析探針插入，用微灌注泵通過(guò)探針的進(jìn)液管，向探針內(nèi)以恒定的速度灌流與腦組織液成分相似的等滲灌流液，此時(shí)膜外小分子物質(zhì)將順濃