ELISA法檢查乙肝表面抗原(1)

1、.實驗五：實驗五：ELISAELISA法檢測乙肝表面法檢測乙肝表面抗原（抗原（HBsAgHBsAg）2014年年11月月.免疫標記技術免疫標記技術定義： 將抗原-抗體反應與標記技術相結合，用放射性同位素、酶或熒光素標記的已知抗體或抗原，通過檢測標記物，間接測定未知的抗原或抗體。分類： 放射免疫測定法：131I，32P 免疫熒光技術：FITC，PE 免疫酶測定法：HRP，AP.免疫酶測定法免疫酶測定法.酶聯免疫吸附試驗酶聯免疫吸附試驗酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,簡稱ELISA，它是實驗室最常用的檢測方法，用酶標記抗原或抗體檢測液體（血

2、液、細胞液）中未知抗體或抗原。 ELISA具有準確性高、檢測時間短、價格低廉、判斷結果有客觀標準、結果便于記錄和保存等優(yōu)點，適合于大批標本的檢測，廣泛應用于食品安全檢測、醫(yī)療檢測以及免疫實驗分析等領域。.(1).抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學活性。例如：蛋白質分子結構上的疏水基團與聚苯乙烯表面的疏水基團能產生互作用而吸附。(2).抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；(3).酶結合物與相應抗原或抗體結合后，可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，由此進

3、行定性或定量分析。2、ELISA基本原理.3、ELISA基本的實驗過程 包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化； 抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結合固定； 酶促反應：在反應體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應而顯色。. ELISA的試劑ELISA中有中有3 3個是必要的試劑：免疫吸附劑、標記物和顯色劑。個是必要的試劑：免疫吸附劑、標記物和顯色劑。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （聚苯乙烯板：具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性）（2）酶標記的抗原或抗體（標記

4、物）；（3）酶作用的底物（顯色劑）；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5）樣品及標準本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液. ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法，主要類型有 雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等。4、ELISA類別.雙抗體夾心法.間接法.以雙抗體夾心法ELISA為例）：）：用抗體包被固相載體加入抗原Sample(二價以上)，溫育加入酶標抗體，溫育加入底物，顯色清洗清洗清洗終止反應，底物顯色深淺與待檢抗原量成正比。利用已知濃度的抗原制成標準品，稀釋為梯度濃度，對其最終OD值與濃

5、度作標準曲線，那么樣品的濃度可以根據最終的OD值在標準曲線上查出。.實驗內容：實驗內容： 雙抗體夾心法測定乙肝表面抗原雙抗體夾心法測定乙肝表面抗原（HBsAg）定性定量檢測定性定量檢測. 1、掌握ELISA（雙抗體夾心法）的原理 2、熟悉ELISA實驗操作方法，并了解其應用實驗目的實驗目的.實驗材料實驗材料HBsAgHBsAg酶聯免疫分析試劑盒酶聯免疫分析試劑盒HBsAgHBsAg陽性品，陰性對照品陽性品，陰性對照品移液槍，槍頭移液槍，槍頭濕盒濕盒酶標板，酶標儀酶標板，酶標儀一次性手套一次性手套記號筆記號筆計時器計時器.實驗步驟實驗步驟.結果判定結果判定定性測定定性測定的結果判斷作出“有”或“

6、無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。待測孔（P）與對照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽性，N為陰性對照孔。定量測定：酶標儀測定450nm波長下的OD值，根據標準曲線計算樣品抗原的濃度。. 陽性：顯色為黃色 陰性：無色1 2 3 4陰性陰性陰性陰性 陽性陽性陽性陽性.ELISAELISA注意事項注意事項 加樣應加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，避免產生氣泡并迅速完成；一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。 洗滌必須徹底，防止產生假陽性； 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。 ELISA板放在濕盒內，可在盒底