脲酶活性的測定

1、大豆制品中脲酶活性的測定定性法：酚紅法一、原理：時由黃變紅，大豆制品中所含的尿素酶在 pH=7.0, T=30C時可 將尿素水解產(chǎn)生氨， 釋放的氨可使酚紅指示劑變紅， 根據(jù)變紅的時間 長短來判斷脲酶活性的大小。二、儀器和試劑：粉碎機(jī)：粉碎時不產(chǎn)生強(qiáng)烈發(fā)熱；分析天平；25ml 納式比色管；恒溫水浴鍋；0.1%酚紅指示劑： 0.1g 苯酚紅溶于 100ml 95%乙醇溶液； 結(jié)晶尿素；三、方法：±0.001g 試樣于 25ml 納式比色管，參加 0.2g 結(jié)晶尿素及 5 滴 酚紅指示劑，參加25ml蒸餾水，搖動10s，立即置于30士 C水浴鍋 中，開始計時，觀察溶液顏色變化， 5min

2、后，取出比色管，搖勻， 觀察溶液顏色。空白試驗(yàn)：不加尿素，其他同上。品質(zhì)判定： 如果溶液為明顯的粉紅色， 那么認(rèn)為該大豆制品脲酶活 性超標(biāo)，為不合格產(chǎn)品。? 0-1min變紅，活性非常強(qiáng) 1.0? 1-2min 變紅，活性大概 0.5-1.0 ；? 2-5min 變紅，活性大概 0.3-0.5 。四、考前須知：1. 粉碎樣品時，不應(yīng)產(chǎn)生大量熱，否那么會影響結(jié)果判定；2. 稱量樣品時，一定要將樣品混合均勻，否那么會造成試驗(yàn)誤差；3. 試樣和空白試驗(yàn)同時操作，過程要迅速，防止時間影響。尿素-酚紅法一、原理：酚紅指示劑在 pH 6.4-8.2 時由黃變紅，大豆制品中所含的尿素 酶可將尿素水解產(chǎn)生氨，

3、 釋放的氨可使酚紅指示劑變紅， 根據(jù)變紅樣 品占所有樣品的比例來判斷脲酶活性的大小。二、儀器和試劑：外表皿；0.2N 氫氧化鈉溶液：稱取 0.8g 氫氧化鈉溶于 100ml 蒸餾水；1.0N 硫酸溶液：移取 7.0ml 濃硫酸溶于 500ml 蒸餾水；尿素- 酚紅試劑：用 500ml 燒杯將 0.8g 酚紅溶于 20ml 0.2N 氫氧 化鈉溶液，用蒸餾水稀釋至約300ml，參加60g尿素，并溶解之，轉(zhuǎn) 移至 2L 容量瓶，沖洗燒杯數(shù)次，參加 ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸餾水 定容至2L;此時溶液應(yīng)具有明亮的琥珀色；過段時間溶液會變?yōu)樯?橘紅色，可滴入稀硫酸溶液攪拌之，直至溶液再次變?yōu)殓晟?/p>

4、三、方法：將一滿匙樣品放入外表皿中，攤平，將以調(diào)好的尿素 - 酚紅試劑 滴入外表皿中的樣品上，直至完全浸濕，停留5mi n，觀察樣品的顏色反響。如果紅斑面積多于 20%，那么認(rèn)為該樣品脲酶活性超標(biāo)，為不 合格產(chǎn)品。四、考前須知：1. 對于樣品較粗、 具有大塊狀的樣品，最好將其稍微粉碎，亦不 可太細(xì)，否那么不容易觀察；2. 樣品一定要鋪平，容易觀察；3. 溶液保質(zhì)期為 3個月，最好 1個月內(nèi)用完；定量法：滴定法一、原理：在30士C下精確保溫 30min,尿素酶催化尿素水解產(chǎn)生氨的反 應(yīng)，用過量鹽酸中和所產(chǎn)生的氨，再用 KOH標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴，以每克大 豆制品每分鐘分解尿素所釋放的氨態(tài)氮的含量來表示脲

5、酶活性的大 小。二、儀器和試劑：粉碎機(jī)：粉碎時不應(yīng)產(chǎn)生大量熱；分析天平；25ml 納式比色管；恒溫水浴鍋；堿式滴定管；尿素-磷酸鹽緩沖液：溶液3.403g磷酸二氫鉀于約100ml新蒸餾 水,溶解 4.335g 磷酸氫二鉀于約 100ml 新蒸餾水,然后將；兩種溶 液合并配成1L，其pH應(yīng)為7.0。再將30g尿素溶解于此緩沖溶液中， 有效期一個月現(xiàn)配現(xiàn)用 ；鹽酸溶液： 0.1mol/L ；氫氧化鉀溶液： 0.1mol/L ；混合指示劑；三、方法：樣品粉碎，并且全部過200um樣品篩。粉碎時不可產(chǎn)熱稱取 0.2g 準(zhǔn)確至 0.0002g 樣品于納式比色管中，加 10ml 尿 素緩沖液，立即蓋好劇烈

6、振搖后，馬上置于30士C水浴鍋內(nèi)，準(zhǔn)確計時30min士 10s要求每個試樣參加尿素緩沖液的時間間隔保持一 致。停止反響時再以相同的時間間隔參加 10ml 鹽酸 0.1 mol/L ， 振搖后迅速冷卻至20C，將比色管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入錐形瓶中，用20ml 蒸餾水沖洗數(shù)次，加8-10滴混合指示劑，以KOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán) 綠色。另取納式比色管作空白， 稱 0.2g 樣品，參加 10ml 鹽酸， 振搖后 加10ml尿素緩沖液，立即蓋好劇烈振搖，馬上置于30 士 C水浴鍋，計時保持30min士 10s，停止反響時將其迅速冷卻至 20C將比色管內(nèi) 容物全部轉(zhuǎn)入錐形瓶中， 用 20ml 蒸餾水沖洗數(shù)次， 加 8-10 滴混合指 示劑，以KOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)綠色。四、計算：X=(Coh*V0-V 14/ m- 30；X：單位mg/ g - min，以氨態(tài)氮計；Qoh氫氧化鉀濃度；V0:空白消耗氫氧化鉀溶液的體積，ml;V:樣品消耗氫氧化鉀的體積，ml;14：氮的摩爾質(zhì)量， g/mol ；m樣品質(zhì)量，g;30：反響時間， min；五、考前須知：1. 粉碎樣品時，不應(yīng)產(chǎn)生大量熱，否那么會使結(jié)果偏低；2. 稱量樣品時，一定要將樣品混合