微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程一、目的：建立微生物限度檢查的基本操作規(guī)程， 為微生物檢查人員 提供正確的操作規(guī)程。二、適用范圍：適用于品管化驗(yàn)室的微生物限度檢查。三、職責(zé)：品管微生物檢驗(yàn)員對本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施負(fù)責(zé)。四、正文：1 定義：微生物限度檢查法： 系指非規(guī)定滅菌制劑及其原輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。2 實(shí)驗(yàn)用具：電熱恒溫培養(yǎng)箱、 電熱恒溫水溫箱、 試管、刻度吸管、量筒、三角瓶、 培養(yǎng)皿、試管架、注射器、針頭、注射器盒、研缽、75%酒精棉球、紫外燈（ 365nm 波長）。3 培養(yǎng)基：3.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、蛋白胨水 培養(yǎng)基。3.2

2、 培養(yǎng)基的管理、配制應(yīng)符合檢定菌、培養(yǎng)基管理規(guī)程、培養(yǎng)基配 制規(guī)程。4試液：甲基紅試液、a奈酚乙醇試液、40%氫氧化鉀溶液、靛基質(zhì) 試液。5 稀釋劑： 0.9%無菌氯化鈉溶液。6 供試品溶液的制備： 取供試品（供試品如為固體，置研缽中研磨成 細(xì)粉）放入試管中，加入適量的稀釋劑制成 1： 10 濃度的供試品溶 液。7 對照用菌液： 控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的對照試驗(yàn)， 對照菌株 為大腸桿菌 CMCC（ B） 441022。取相應(yīng)菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面 新鮮培養(yǎng)物 1 白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)， 培養(yǎng) 18-20 小時， 稀釋至 1： 106，對照菌的加入量為 50-100 個。8 檢查

3、法：8.1除另有規(guī)定外，細(xì)菌的培養(yǎng)溫度為30-35C，霉菌的培養(yǎng)溫度為25-28C，控制菌的培養(yǎng)溫度為 35士 1C。8.2細(xì)菌、霉菌計數(shù)：821平皿菌落計數(shù)法取均勻供試液，進(jìn)一步稀釋成 1: 102、1: 103 等適宜的稀釋級。分別取連續(xù)三級 10倍稀釋的供試液各1ml，置直 徑約90mm的平皿中，再注入約45C的培養(yǎng)基約15ml，混勻，等凝 固后，倒置培養(yǎng)，每個稀釋級應(yīng)作 23個平皿。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計數(shù)。8.2.2菌數(shù)測定陰性對照試驗(yàn)取供試驗(yàn)用的稀釋劑各1ml，置4個無菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌計數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查， 不得長菌。8.2

4、.3細(xì)菌培養(yǎng)時間為48小時，分別在24小時及48小時點(diǎn)計菌落 數(shù)，一般以48小時菌落數(shù)為準(zhǔn)，霉菌培養(yǎng)時間為72小時，分別在 48小時及72小時點(diǎn)計菌落數(shù)，一般以72小時菌落數(shù)為準(zhǔn)。菌落如 蔓延生長成片，不宜計數(shù)。8.2.4點(diǎn)計后，計算各稀釋級的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌 數(shù)。8.2.5菌數(shù)報告規(guī)則：細(xì)菌宜選取平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋級, 霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30-100之間的稀釋級，作為報告菌數(shù)計算 的依據(jù)。如只有1個稀釋級菌落數(shù)在30-300 (30-100)之間時，將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如同時有兩個稀釋級在30-300 (30-100)之間時， 按下式計算兩

5、級比值。比值二低稀釋級平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)高稀釋級平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù).當(dāng)比值W 2時，以兩稀釋級的均值報告，當(dāng)比值2時以低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如同時有3個稀釋級的平均菌落數(shù)均在30-300 (30-100)之間時，以后兩個稀釋級計算級間比值，如各 稀釋級的平均菌落數(shù)均不在 30-300 ( 30-100)之間，以最接近30或 300的稀釋級平均菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如各稀釋級平均菌落數(shù)均 在300 (100)以上，按最高稀釋級菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如各稀釋級平均菌落數(shù)均小于 30 時，一般按最低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀 釋倍數(shù)報告，如當(dāng) 1：10（ 1： 100）稀釋級平均菌落數(shù)等于

6、或大于 原液（或 1：10）時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測定， 按測定結(jié)果報告菌數(shù)。 8.2.6 培養(yǎng)基稀釋法：取供試液（原液或 1：10 供試液） 3 份，每份 各1ml，分別注入5個平皿內(nèi)（每皿各0.2ml）每個平皿中傾注營養(yǎng) 瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后倒置培養(yǎng)，計數(shù)，每1ml注入的5 個平板點(diǎn)計的菌落數(shù)之和即為每 1ml 的菌落數(shù)，共得 3 組數(shù)據(jù)， 以 3 份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。 如各稀釋級平板均無菌落生長， 或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于 1 時， 則報告菌數(shù)為小于 10 個。8.3控制菌檢查除另有規(guī)定外，取供試液 10ml （相當(dāng)于供試品1g、 1ml、cm2），直

7、接或處理后接種，經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏 染色、生化試驗(yàn)等項檢查。8.3.1 大腸菌群：8.3.1.1 檢樣稀釋及培養(yǎng) 以無菌操作，將檢樣25g（ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水的 滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠） ，經(jīng)充分振搖或研磨做 成 1：10 的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好在均質(zhì)器 中以8000 10000r/min的速度處理1min，作成1： 10的均勻稀釋 液。 用1ml滅菌吸管吸取1: 10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖不要接觸管內(nèi)稀釋液） ，混合均 勻，做成 1： 100 的稀釋液。 另取 1ml 滅菌吸管

8、，按上述操作順序，做 10 倍遞增稀釋液。如 此每次遞增稀釋一次， 即換用一支 1ml 滅菌吸管。 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或標(biāo)本污染情況的估計，選擇 3 個合適的 稀釋度，每個稀釋度接種三管。8.3.1.2 乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在 1ml 以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml 及 1ml 以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。 每一稀釋度接種三管， 置36士 1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24士 2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣， 則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。8.3.1.3 分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上， 置36 士 1 C溫箱內(nèi)，

9、培養(yǎng)1824h,然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試 驗(yàn)。8.3.1.4 證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落 12 個進(jìn)行革蘭氏染色，同 時接種乳糖發(fā)酵管， 置36士 1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24 2h，觀察產(chǎn)氣情 況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大 腸菌群陽性。8.3.1.5 報告：根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)， 查 MPN 檢索表，報 告每100ml (g)大腸菌群的MPN值。9 結(jié)果判斷：9.1 細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌菌落數(shù)、控制菌三項均符合該品種微生物限度 項下的規(guī)定， 應(yīng)判為供試品符合規(guī)定； 其中任何一項不符合該品種項 下規(guī)定，應(yīng)判供試品不符合規(guī)定。9.2 細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌菌落數(shù)第一次測定超過該品種項下微生物限度 規(guī)定時， 應(yīng)從同一批號樣品中隨機(jī)抽樣，復(fù)試兩次，以三次結(jié)果平均 值報告。9.3