香辛方外敷對(duì)肺癌骨癌痛小鼠炎性介質(zhì)和MCP-1的影響

1、香辛方外敷對(duì)肺癌骨癌痛小鼠炎性介質(zhì)和MCP-1的影響何佩珊1，馮興中1，姜敏1，潘國(guó)鳳1，楊公博2，楊萌3，齊慧3 摘要目的：應(yīng)用活體熒光成像肺癌骨轉(zhuǎn)移癌模型，探討香辛方外敷緩解骨轉(zhuǎn)移癌痛的機(jī)制。方法：通過(guò)股骨內(nèi)注射表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺腺癌A549細(xì)胞建立肺癌骨轉(zhuǎn)移癌模型，隨機(jī)分為中藥外敷組、扶他林組、模型組，每組10只。中藥外敷組香辛方0.5 g/(kg·d) 外敷，造模后721天，1次/d；扶他林組0.1 g/(kg·d) 外涂，造模后721天，1次/d；模型組生理鹽水0.5 mL/只外涂，1次/d；另設(shè)假手術(shù)組生理鹽水0.5 mL/只外涂，1次/d。造模21 d后檢

2、測(cè)小鼠血脊髓單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF）以及白介素-6（IL-6）的表達(dá)水平。結(jié)果：MCP-1表達(dá)模型組脊髓MCP-1表達(dá)水平(1.88±0.18) mg/L比假手術(shù)組(1.21±0.19) mg/L高，中藥外敷組脊髓MCP-1表達(dá)水平(1.51±0.09) mg/L比模型組和扶他林組(1.67±0.11) mg/L降低（均P<0.05）。IL-1水平扶他林組(99.11±10.52) ng/L和模型組(104.46±11.07) ng/L IL-1水平比假手術(shù)組(75.69

3、±16.57) ng/L高，中藥外敷組IL-1水平(85.97±11.88) ng/L比模型組和扶他林組低（均P<0.05）。TNF水平中藥外敷組(447.91±44.67) ng/L、扶他林組(504.14±44.30) ng/L和模型組(534.84±48.89) ng/L TNF水平均比假手術(shù)組(357.69±35.96) ng/L升高，中藥外敷組TNF水平比模型組和扶他林組低（均P<0.05）。IL-6水平各組小鼠IL-6水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：香辛方可能通過(guò)減少脊髓MCP-1蛋白的表達(dá)，

4、抑制中樞敏化；同時(shí)降低血IL-1和TNF水平。本方可能通過(guò)下調(diào)炎性介質(zhì)表達(dá)，起到緩解骨轉(zhuǎn)移癌痛的作用。關(guān)鍵詞：芳香中藥；骨轉(zhuǎn)移癌痛；熒光成像；炎性介質(zhì)；單核細(xì)胞趨化蛋白-1中圖分類(lèi)號(hào)：Q95-33；R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-6948(2019)03-0000-00doi：10.3969/j.issn.1007-6948.2019.03.000Effect of Xiangxin Prescription on Inflammatory Medium and MCP-1 in Mice with Bone Metastatic Cancer PainHE Pei-shan

5、, FENG Xing-zhong, JIANG Min, et al. Department of Traditional Chinese Medicine, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing (100038), ChinaAbstract: ObjectiveTo explore the mechanism of Xiangxin Prescription on relieving bone metastatic cancer pain using in vivo fluorescence imag

6、ing model of lung cancer with bone metastasis.MethodsLung cancer bone metastatic pain model was built by injecting human lung adenocarcinoma A549 cells expressing green fluorescent proteins into the femurs of 30 nude mice. After successful modeling, the mice were randomly divided into external appli

7、cation of Chinese herb group, Votalin group and model group, n=10. Sham operation group was also established with other 10 mice. The external application of Chinese herb group was externally given Xiangxin Prescription, 0.5 g/(kg·d); the Votalin group was locally applied with Votalin, with the

8、dose of 0.1 g/(kg·d); the model group and Sham operation group were embrocated with normal saline (0.5 mL). The external application in each group was kept for at least 6 h, once daily. For each group, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), interleukin-l (IL-l), tumour necrosis factor (TNF) an

9、d interleukin-6 (IL-6) were observed after the treatment.ResultsThe level of MCP-1 in model group (1.88±0.18) mg/L was higher than that in Sham operation group (1.21±0.19) mg/L (P<0.05). The level of MCP-1 in Chinese herb group (1.51±0.09) mg/L was less than that in model group (P&

10、lt;0.05). The levels of IL-1 in Votalin group (99.11±10.52) ng/L and model group (104.46±11.07) ng/L were higher than that in Sham operation group (75.69±16.57) ng/L (P<0.05). The level of IL-1 in Chinese herb group (85.97±11.88) ng/L was less than those in Votalin group and m

11、odel group (P<0.05). The level of TNF in Chinese herb group (447.91±44.67) ng/L was less than those in Votalin group (504.14±44.30) ng/L and model group (534.84±48.89) ng/L (P<0.05). The difference of IL-6 level in each group was not significant (P>0.05).ConclusionXiangxin Pr

12、escription could inhibit the expression of MCP-1 and reduce the levels of IL-1 and TNF, which could help to relieve the bone metastatic cancer pain.Key words: Aromatic Chinese herbs; bone metastatic cancer pain; fluorescence imaging; inflammatory medium; monocyte chemotactic protein-1癌性疼痛是晚期腫瘤最常見(jiàn)的癥狀

13、之一1，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量2。前期研究顯示，芳香類(lèi)中藥外敷能降低骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠機(jī)械性痛覺(jué)和熱刺激痛覺(jué)3-4。本研究應(yīng)用活體熒光成像肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，探討芳香類(lèi)中藥外敷緩解骨轉(zhuǎn)移癌痛的機(jī)制，為進(jìn)一步研究其機(jī)理提供依據(jù)。1材料與方法1.1動(dòng)物及細(xì)胞株SPF級(jí)雌性BALB/c-nu小鼠共40只，4周齡，體質(zhì)量（18±2）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的人肺腺癌A549細(xì)胞株，由安泰康生物技術(shù)（北京）有限公司提供。1.2藥物香辛方以丁香、細(xì)辛（12）研磨成粉調(diào)勻，加入透皮吸收劑薄荷醇，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)

14、壇醫(yī)院藥劑室制作。扶他林乳膏劑1% 20 g，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990291，北京諾華制藥有限公司。1.3主要試劑及儀器75%乙醇（批號(hào)11151107），山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)p3761），Sigma公司。注射器（批號(hào)329461），美國(guó)BD公司；FluorVivo-Model-100熒光成像儀，美國(guó)INDEC BioSystems公司；奧豪斯電子精密天平，美國(guó)OHAUS公司（型號(hào)CP323C）；醫(yī)學(xué)圖像采集系統(tǒng)，日本奧林巴斯株式會(huì)社；倒置顯微鏡，日本NIKON株式會(huì)社（型號(hào)MA100）。1.4小鼠骨轉(zhuǎn)移癌痛活體熒光成像模型建立參考文獻(xiàn)5方法，裸鼠麻醉(戊巴比妥鈉麻醉)

15、后，仰臥，腹部朝上，用75%乙醇消毒股骨處皮膚。膝關(guān)節(jié)處與股骨垂直方向切一長(zhǎng)0.30.5 cm的皮膚切口，小心暴露髕骨。先用一次性無(wú)菌1mL注射器針頭在髕骨沿股骨長(zhǎng)軸方向穿刺打孔，然后換上30 L注射器進(jìn)入股骨骨髓腔，緩慢注入50 L表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺腺癌A549細(xì)胞（1×106/mL）至股骨。注射完畢，用骨蠟封住針孔（圖1）。無(wú)菌棉簽蘸生理鹽水清洗創(chuàng)口，皮膚縫合。建模后第3 d，以FluorVivo-Model-100熒光成像儀對(duì)所有小鼠進(jìn)行全身成像（圖2）。假手術(shù)組在股骨注入等體積的生理鹽水，其余操作同上。造模第7 d，小鼠縮足反應(yīng)增多，表明癌痛模型造模成功3。圖1小鼠肺癌骨

16、轉(zhuǎn)移癌痛造模照片 圖2骨轉(zhuǎn)移癌痛模型熒光顯像圖1.5分組與給藥將造模成功的30只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為中藥外敷組、扶他林組、模型組，每組10只；另設(shè)假手術(shù)組10只。中藥外敷組給予香辛方0.5 g/(kg·d)，于術(shù)后721天相同時(shí)間（9：00）外敷。于手術(shù)切口旁開(kāi)約0.2 cm局部貼敷，至少持續(xù)6 h，1次/d。扶他林組（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組）給予扶他林局部用藥0.1 g/(kg·d)，于相同時(shí)間進(jìn)行局部涂抹，1次/d。模型組（一般對(duì)照組）和假手術(shù)組（無(wú)腫瘤負(fù)荷）給予涂擦生理鹽水0.5 mL/只，1次/d。1.6觀察指標(biāo)及方法采集標(biāo)本進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。造模21天后，麻醉處死小鼠，在冰上

17、剝離出小鼠腰椎（L3L5）脊髓，迅速放入液氮中保存。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血漿（或血清）白介素-l（interleukin l，IL-l）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor , TNF）及脊髓組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的含量。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用單因素方差分析

18、，后采用SNK進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1腰椎脊髓MCP-1的表達(dá)經(jīng)SNK法多重比較顯示，各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組脊髓MCP-1表達(dá)比假手術(shù)組升高（P<0.01），提示骨癌痛小鼠出現(xiàn)了痛覺(jué)中樞敏化。中藥外敷組脊髓MCP-1的表達(dá)比模型組和扶他林組降低（P<0.01）。見(jiàn)表1 。表1各組小鼠腰椎脊髓MCP-1的表達(dá)比較 組別例數(shù)（n）MCP-1（mg/L）假手術(shù)組101.21±0.19模型組101.88±0.18a扶他林組101.67±0.11中藥外敷組101.51±0.0

19、9bc注：a 與假手術(shù)組比較， P<0.01；b與模型組比較，P<0.01；c與扶他林組比較，P<0.05。2.2血IL-1水平經(jīng)SNK法多重比較顯示，IL-1水平扶他林組和模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中藥外敷組和假手術(shù)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。扶他林組和模型組IL-1水平比假手術(shù)組高（P<0.05）。中藥外敷組IL-1水平比模型組和扶他林低（P<0.05）。見(jiàn)表2。表2各組小鼠血IL-1水平比較 組別例數(shù)（n）IL-1（ng/L）假手術(shù)組1075.69±16.57模型組10104.46±11.07a扶他林組1099.1

20、1±10.52a中藥外敷組1085.97±11.88bc注：a與假手術(shù)組比較，P<0.01；b與模型組比較，P<0.01；c與扶他林組比較，P<0.052.3血TNF水平經(jīng)SNK法多重比較顯示，TNF水平扶他林組和模型組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥外敷組、扶他林組和模型組TNF水平均比假手術(shù)組高（P<0.05）。提示肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠血TNF水平升高。中藥外敷組TNF水平比模型組和扶他林組低（均P<0.05）。見(jiàn)表3。表3各組小鼠血TNFa水平比較 組別例數(shù)（n）TNF（ng/L）假手術(shù)組10357.69

21、77;35.96模型組10534.84±48.89a扶他林組10504.14±44.30a中藥外敷組10447.91±44.67abc注：a與假手術(shù)組比較，P<0.01；b與模型組比較，P<0.05；c與扶他林組比較，P<0.012.4血IL-6水平經(jīng)方差分析，各組小鼠IL-6水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。表4各組小鼠血IL-6水平比較 組別例數(shù)（n）IL-6（ng/L）假手術(shù)組10100.71±12.62模型組10115.14±17.63扶他林組10123.17±21.48中藥外敷組10125

22、.12±24.79注：組間比較無(wú)顯著差異，P0.053討論骨轉(zhuǎn)移癌痛成因復(fù)雜，造成骨質(zhì)破壞、骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫、高鈣血癥等，是晚期骨轉(zhuǎn)移患者最痛苦的癥狀之一。骨轉(zhuǎn)移癌屬中醫(yī)文獻(xiàn)中“骨瘤”、“骨蝕”、“骨疽”、“骨痹”等范疇，清代外科證治全書(shū)又有“貼骨瘤，貼骨而生，極疼痛”記載。目前中醫(yī)治療多以補(bǔ)腎、活血為主6。中藥外治法為體表直接給藥，藥力直達(dá)病所，止痛迅速有效，且可避免藥物內(nèi)服帶來(lái)的某些副作用。因此，中藥外治骨癌痛更具優(yōu)勢(shì)。吳師機(jī)理瀹駢文云：“外治之理，即內(nèi)治之理，外治之藥，即內(nèi)治之藥，所異者法耳。醫(yī)理藥性無(wú)二，而法則神奇變化?！睆埦霸涝诰霸廊珪?shū)雜證謨積聚中云：“凡堅(jiān)硬之積

23、，必在腸胃之外，募原之間，原非藥力所能卒至。宜用阿魏膏、琥珀膏，或水紅花膏、三圣膏之類(lèi)，以攻其外。再用長(zhǎng)桑君針?lè)ǎ怨テ鋬?nèi)”。對(duì)于癌性疼痛的病因，首先表現(xiàn)為局部的占位，阻滯經(jīng)絡(luò)氣血的實(shí)性疼痛，因?qū)嵵峦?。芳香?lèi)中藥具有走竄定痛的作用，同時(shí)其揮發(fā)油能促進(jìn)其他藥物透皮吸收，因此在疾病外治中應(yīng)用廣泛。研究表明，骨癌所觸發(fā)的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的興奮性變化，以及脊髓神經(jīng)化學(xué)變化、細(xì)胞重塑是構(gòu)成其行為痛過(guò)敏的物質(zhì)基礎(chǔ)。骨癌導(dǎo)致初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元興奮性異常增加的因素來(lái)自兩個(gè)方面：一是破骨細(xì)胞的過(guò)度激活；二是腫瘤細(xì)胞分泌TNF、IL-1、內(nèi)皮素-1等因子。另外腫瘤組織中有20%30%的巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生TNF和IL-1等，

24、二者也均能興奮初級(jí)傳入神經(jīng)元7-8。而且骨癌痛動(dòng)物初級(jí)傳入神經(jīng)元受到敏化與骨質(zhì)破壞程度、腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)。OPG/RANK/RANKL通路是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和生存的關(guān)鍵途徑。在惡性腫瘤的早期階段，患者骨髓中即可分離出播散腫瘤細(xì)胞（disseminated tumor cells，DTCs）9-10。DTCs可分泌IL-1、IL-6、MIP1a激活破骨細(xì)胞的生成，這些因子與前體破骨細(xì)胞表面的核因子B的受體激活劑（receptor activator of NF-B，RANK）相互作用可活化下游的許多細(xì)胞間的信號(hào)通路：NF-B（nuclear factor-kappa B）、JUN 激酶及CaN/N

25、FAT信號(hào)傳導(dǎo)通路，這些信號(hào)途徑的激活促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成、成熟和存活。除了促進(jìn)新生的破骨細(xì)胞形成，DTCs還可與骨髓中其他細(xì)胞相互作用，加強(qiáng)已存在的破骨細(xì)胞中的溶骨性骨吸收作用。DTCs分泌的前列腺素（prostaglandins）、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroid hormonerelated peptide，PTHrP）、活化的維生素D、IL-6及TNF可上調(diào)成骨細(xì)胞及骨基質(zhì)細(xì)胞表面的RANKL表達(dá)11。Miossec等12研究表明：普遍存在于骨髓中的T細(xì)胞也可分泌激活破骨作用的因子。DTCs分泌的IL-6、IL-

26、1及TGF-可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞，該細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-17促進(jìn)破骨作用并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表面RANKL的表達(dá)。本研究結(jié)果提示，肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠可見(jiàn)血IL-1、TNF水平升高。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，芳香類(lèi)中藥外敷不僅促進(jìn)藥物透皮吸收，緩解患者骨轉(zhuǎn)移癌痛13。骨癌痛小鼠模型造模成功后第21 d，中藥外敷組小鼠縮足反應(yīng)百分率（23.10±3.38）%比扶他林組（32.70±4.45）%和模型組（52.20±5.61）%少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥外敷組熱刺激過(guò)敏為（14.10±3.68）s，比扶他林組（10.70±3.2

27、3）s和模型組（6.90±2.64）s延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明芳香類(lèi)中藥外敷降低骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠機(jī)械性痛覺(jué)和熱刺激痛覺(jué)4；另外還對(duì)骨轉(zhuǎn)移瘤有一定的抑制作用5。香辛方可以降低血IL-1水平和TNF水平，可能通過(guò)下調(diào)炎性介質(zhì)表達(dá)起到緩解骨轉(zhuǎn)移癌痛的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，丁香（油）可明顯提高小鼠機(jī)械性壓痛痛閾值14。其有效成分丁香苷對(duì)小鼠熱板試驗(yàn)、醋酸扭體試驗(yàn)有一定鎮(zhèn)痛作用15。細(xì)辛對(duì)抗炎、鎮(zhèn)痛具有明確作用16，對(duì)多種疼痛動(dòng)物模型具有良好的鎮(zhèn)痛作用。與嗎啡比較，其鎮(zhèn)痛作用起效慢, 但作用時(shí)間長(zhǎng)17。目前，中醫(yī)外治癌痛的常見(jiàn)機(jī)制有，抑制炎性介質(zhì)，抑制破骨細(xì)胞活化，抑制脊髓

28、初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元活化，抑制中樞敏化，抑制離子通道等。腫瘤組織及周?chē)难仔约?xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，可分泌不同類(lèi)型的炎性介質(zhì)，包括TNFa、內(nèi)皮素-1、IL-1和IL-6等，通過(guò)各自的受體，直接或間接致敏初級(jí)傳入神經(jīng)元18。骨內(nèi)和周?chē)某跫?jí)傳入神經(jīng)元含有獨(dú)特的蛋白，協(xié)助骨癌痛相關(guān)的溫度，機(jī)械性或化學(xué)刺激的傳導(dǎo)19。同時(shí)，還涉及其他間接機(jī)制，如腫瘤相關(guān)免疫調(diào)節(jié)，骨細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中釋放的介質(zhì)誘導(dǎo)溫度、機(jī)械和化學(xué)刺激，隨后引起疼痛感受器的激活。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，骨癌痛模型小鼠脊髓MCP-1的表達(dá)上調(diào)，提示骨癌痛小鼠出現(xiàn)了痛覺(jué)中樞敏化，這與以往的研究結(jié)果一致。中藥外敷方可以使脊髓M

29、CP-1表達(dá)下降，抑制中樞敏化而起到止痛作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理痛大鼠模型上，背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角的磷酸化蛋白質(zhì)激酶B陽(yáng)性神經(jīng)元顯著增加20-21。金迪等22對(duì)骨癌痛大鼠鞘內(nèi)給予MCP-1中和抗體后，脊髓p-Akt表達(dá)降低，并使機(jī)械痛閾明顯降低，說(shuō)明脊髓MCP-1可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路參與了大鼠骨癌痛的形成。骨轉(zhuǎn)移癌痛是機(jī)制復(fù)雜的慢性疼痛，中藥復(fù)方對(duì)骨癌痛的鎮(zhèn)痛也是從多環(huán)節(jié)、多因素來(lái)發(fā)揮作用的。本方對(duì)腫瘤生成的其他分子機(jī)制是否仍有抑制作用，我們將在下一步的課題研究中繼續(xù)深入研究。參考文獻(xiàn)：1 Clohisy D, Mantyh P. Bone cancer pain J. C

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