養(yǎng)精種玉湯對(duì)CHL細(xì)胞株染色體畸變影響研究

1、養(yǎng)精種玉湯對(duì)CHL細(xì)胞株染色體畸變影響研究                    作者：趙新廣， 尤昭玲， 劉丹卓  【摘要】   目的探討?zhàn)B精種玉湯對(duì)CHL細(xì)胞株染色體畸變的影響，對(duì)其遺傳安全性進(jìn)行研究。方法采用CHL細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，設(shè)養(yǎng)精種玉湯不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞進(jìn)行體外染毒，觀察其致CHL細(xì)胞株染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果在5 000，2 500，1 250 g/ml不同測(cè)試劑量濃度下

2、，無(wú)論24 h及48 h收集細(xì)胞，并在+S9與-S9兩種測(cè)試條件下，進(jìn)行染色體畸變分析，各劑量組、溶劑對(duì)照染色體畸變率均在正常范圍。結(jié)論養(yǎng)精種玉湯在實(shí)驗(yàn)所確定的5 000 g/ml測(cè)試劑量濃度以下，初步認(rèn)為無(wú)誘發(fā)CHL染色體畸變作用。 【關(guān)鍵詞】   養(yǎng)精種玉湯 遺傳毒性 CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Yang Jing Zhong Yu Decoction  on CHL chromosomal aberration.MethodsThe CHL cell was poisoned by Y

3、ang Jing Zhong Yu Decoction at different doses in vitro  with cell training techniques,chromosomal variety of CHL was observed.ResultsAll the CHL chromosomal aberration rates were normal for Yang Jing Zhong Yu Decoction at the concentrations of  5 000,2 500,1 250 g/ml，and collecting time p

4、oints after 24h and 48h，mixing into S9 or non-mixing into S9 in all Yang Jing Zhong Yu Decoction groups. ConclusionThe experiment effects indicate that it has no genetic toxicity of Yang Jing Zhong Yu Decoction at the concentration of 5 000 g/ml.Key words：Yang Jing Zhong Yu Decoction;  Genetic

5、toxicity;  CHL chromosomal aberration test    養(yǎng)精種玉湯乃清代山西太原府名醫(yī)傅山所創(chuàng)，出自傅青主女科，原為 治療 身瘦不孕，后經(jīng)多年來(lái)臨床醫(yī)家們的反復(fù)實(shí)踐與錘煉，現(xiàn)已演繹成為治療不孕癥的基礎(chǔ)方。養(yǎng)精種玉湯廣泛用于種子期,其藥效已較為肯定,但其臨床運(yùn)用安全性研究至今未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，并缺乏臨床運(yùn)用后安全性流行病學(xué)調(diào)查資料。鑒于此，本研究通過(guò)其不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞株體外染毒，進(jìn)行遺傳毒性測(cè)定,以期獲得其繼藥效學(xué)之后的臨床前毒效學(xué)資料，為其種子期合理和安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)。 1  材料與儀器 1.1

6、0; 藥液制備對(duì)所需中藥材的來(lái)源及品種進(jìn)行鑒定，篩選優(yōu)質(zhì)正品，原料經(jīng)品種鑒定無(wú)誤后，再進(jìn)行挑選和洗凈，然后炮制、切片、烘干、粉碎。嚴(yán)格按照經(jīng)典處方比例用量配備，采用制備工藝如下： 取經(jīng)加工炮制的標(biāo)準(zhǔn)中藥飲片（白芍、山茱萸）用70%乙醇回流提取2次，1 h/次，合并提取液濾過(guò)，回收乙醇;其余藥與白芍、山茱萸藥渣混合，水液煎煮2次，1.5 h/次，合并濾液，濾過(guò)濾液濃縮至相對(duì)密度為1.11.2（5060），加入乙醇使醇含量達(dá)65%，冷藏24 h，醇液濾過(guò)，濾液回收乙醇，至無(wú)醇味； 以上兩液合并，冷藏放置，視無(wú)沉淀析出； 添加蒸餾水，調(diào)pH值至6.57.0, 并調(diào)整至相當(dāng)于含生藥2 g/ml； 精濾

7、、灌封、滅菌即得。1.2  細(xì)胞株 中國(guó) 倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（CHL）由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供。由液氮冷凍保存。采用細(xì)胞培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)液補(bǔ)加10%胎牛血清，在37、5%CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。1.3  試劑與儀器HAM F12培養(yǎng)基：GIBCO公司出品；胎牛血清：北京元亨金馬出品；DMSO：北京化學(xué)試劑公司出品；天平：瑞士METTLER TOLEDO  AL204DU-IC型；生物安全柜：美國(guó)Labconco  DELTA型；恒溫?fù)u床：上海智城ZHWY-200B型。1.4  陽(yáng)性對(duì)照劑間接誘變劑為環(huán)磷酰胺（Cyclophosphomide）

8、，代號(hào)CP，來(lái)源于上海華聯(lián)制藥有限公司/011204，外觀為白色粉劑，用生理鹽水配制成20 mg?ml-1母液，現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋成50 g?ml-1應(yīng)用液。直接誘變劑為絲裂霉素C(Mitomycin C),代號(hào)MMC，來(lái)源于Kyowa Hakko Kogyo Co.ltd/333AJG，外觀為灰色粉劑，用生理鹽水配制成200 g?ml-1母液，現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋成25 g?ml-1應(yīng)用液。 2  方法 2.1  S9活化系統(tǒng)制備取體質(zhì)量160200 g的健康Sprague-Dawley SPF/VAF大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)200

9、7-0001。腹腔注射多氯聯(lián)苯玉米油溶液，5 d后頸椎脫臼處死，制備肝勻漿。勻漿以9 000 g離心取上清液(S9)分裝,液氮冷凍保存;臨用時(shí)，取S9進(jìn)行S9混合液配制。2.2  分組依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)采用MTT方法觀察養(yǎng)精種玉湯不同濃度對(duì)CHL細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用結(jié)果，設(shè)3個(gè)劑量組濃度分別為5 000，1 500，1 250 g/ml。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照、S9對(duì)照及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照。2.3  操作步驟及檢測(cè)指標(biāo)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHL細(xì)胞培養(yǎng)體系，正常對(duì)照或3個(gè)劑量組分別加入相應(yīng)劑量的應(yīng)用液，加樣體積均為40 l，陽(yáng)性對(duì)照按照各自的濃度要求加入適當(dāng)體積的溶液。其中，在-S9mix的條件下

10、，不同濃度藥物的作用時(shí)間各取兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即24 h和48 h；+S9mix 時(shí)藥物作用于細(xì)胞的時(shí)間為6 h，然后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。終止培養(yǎng)前2 h秋水仙堿處理; 0.25%胰蛋白酶液消化;離心管離心;低滲液低滲;固定液固定;離心,重復(fù)1次;滴片,酒精燈上干燥;10%Giemsa 染色制片。指標(biāo)檢測(cè)，每個(gè)濃度組至少觀察100個(gè)中期分裂相，在油鏡下分別記錄細(xì)胞染色體的數(shù)量變化及畸變類型，然后根據(jù)畸變細(xì)胞數(shù)算得畸變率。結(jié)構(gòu)畸變包括染色體型畸變和染色單體畸變，畸變類型包括斷裂、缺失、易位、雙著絲點(diǎn)和環(huán)等。2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SAS 9.13版軟件由 計(jì)算 機(jī)完成，計(jì)

11、數(shù)資料進(jìn)行2檢驗(yàn)。 3  結(jié)果 直接誘變劑絲裂霉素C（MMC）在25 g/ml濃度下,CHL細(xì)胞染色體畸變率顯著增高至60%，間接誘變劑環(huán)磷酰胺（CP）在50 g/ml濃度下，并在S9活化條件下染色體畸變率顯著增高至70%，而溶劑對(duì)照組在+S9及-S9兩種測(cè)試條件下,染色體結(jié)構(gòu)畸變率均小于5%，且陽(yáng)性對(duì)照與溶劑對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加（P0.01）。養(yǎng)精種玉湯劑量在1 2505000 mg/ml不同濃度范圍內(nèi)，在S9活化和非活化兩種測(cè)試條件下，無(wú)論24 h或48 h收獲CHL細(xì)胞,進(jìn)行染色體畸變分析，染色體畸變率也在正常范圍，并與溶劑對(duì)照比較無(wú)顯著性差異(P0.05)。見(jiàn)表1。

12、表1  養(yǎng)精種玉湯對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變影響（略） 4  討論 染色體是一條雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA鏈和比較松散地結(jié)合在蛋白質(zhì)上的復(fù)合物。它是遺傳單位基因的載體，具有獨(dú)特的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，當(dāng)受到外界誘變物作用時(shí)易出現(xiàn)損傷，即在形態(tài)及結(jié)構(gòu)上發(fā)生畸變。染色體畸變的機(jī)制比較復(fù)雜，一般認(rèn)為，誘變物主要作用于細(xì)胞分裂周期G1期，此時(shí)染色體尚未復(fù)制，易導(dǎo)致染色體損傷產(chǎn)生畸變。由于CHL細(xì)胞株的不同世代之間，在細(xì)胞周期時(shí)間和克隆形成率等參數(shù)上沒(méi)有明顯差異，便于控制實(shí)驗(yàn)條件，且不受動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)及生理、免疫狀態(tài)影響，因而能定量研究，重復(fù)性也好，且能傳代保存，便于進(jìn)行形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)等觀察，并進(jìn)行細(xì)胞化

13、學(xué)、生物化學(xué)等分析。CHL染色體畸變?cè)囼?yàn)是體外細(xì)胞培養(yǎng)染色體正向突變實(shí)驗(yàn)1，不但能判定染色體數(shù)目異常，尚能判定染色體結(jié)構(gòu)變化。養(yǎng)精種玉湯作為助孕名方，備受歷代醫(yī)家所重視。本文采用CHL細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接誘變劑MMC在-S9條件,CHL細(xì)胞染色體畸變率顯著增高至60%，間接誘變劑CP在+S9條件下染色體畸變率顯著增高至70%，而溶劑對(duì)照在+S9及-S9兩種測(cè)試條件下,染色體結(jié)構(gòu)畸變率均小于5%，且陽(yáng)性對(duì)照與溶劑對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加（P0.01），這說(shuō)明試驗(yàn)系統(tǒng)可信。對(duì)養(yǎng)精種玉湯設(shè)5 000，2 500，1 250 g/ml不同劑量對(duì)CHL細(xì)胞進(jìn)行體外染毒，結(jié)果無(wú)論24 h及48 h收集細(xì)胞，并在S9活化與非活化兩種測(cè)試條件下，進(jìn)行染色體畸變分析，各劑量組、溶劑對(duì)照染色體畸變率均在正常范圍，說(shuō)明其在本實(shí)驗(yàn)所確定的5 000 g/ml以下，初步認(rèn)為無(wú)誘發(fā)CHL染色體畸變作用。不過(guò)，染色體畸變?cè)囼?yàn)主觀因素大，尤其采樣時(shí)間的把握對(duì)試驗(yàn)成敗有較大影響，需特殊訓(xùn)練的專業(yè)技術(shù)人員，因此，