養(yǎng)精種玉湯對CHL細胞株染色體畸變影響研究

1、養(yǎng)精種玉湯對CHL細胞株染色體畸變影響研究                    作者：趙新廣， 尤昭玲， 劉丹卓  【摘要】   目的探討?zhàn)B精種玉湯對CHL細胞株染色體畸變的影響，對其遺傳安全性進行研究。方法采用CHL細胞培養(yǎng)技術，設養(yǎng)精種玉湯不同劑量對CHL細胞進行體外染毒，觀察其致CHL細胞株染色體數(shù)目及結(jié)構變化。結(jié)果在5 000，2 500，1 250 g/ml不同測試劑量濃度下

2、，無論24 h及48 h收集細胞，并在+S9與-S9兩種測試條件下，進行染色體畸變分析，各劑量組、溶劑對照染色體畸變率均在正常范圍。結(jié)論養(yǎng)精種玉湯在實驗所確定的5 000 g/ml測試劑量濃度以下，初步認為無誘發(fā)CHL染色體畸變作用。 【關鍵詞】   養(yǎng)精種玉湯 遺傳毒性 CHL細胞染色體畸變試驗Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Yang Jing Zhong Yu Decoction  on CHL chromosomal aberration.MethodsThe CHL cell was poisoned by Y

3、ang Jing Zhong Yu Decoction at different doses in vitro  with cell training techniques,chromosomal variety of CHL was observed.ResultsAll the CHL chromosomal aberration rates were normal for Yang Jing Zhong Yu Decoction at the concentrations of  5 000,2 500,1 250 g/ml，and collecting time p

4、oints after 24h and 48h，mixing into S9 or non-mixing into S9 in all Yang Jing Zhong Yu Decoction groups. ConclusionThe experiment effects indicate that it has no genetic toxicity of Yang Jing Zhong Yu Decoction at the concentration of 5 000 g/ml.Key words：Yang Jing Zhong Yu Decoction;  Genetic

5、toxicity;  CHL chromosomal aberration test    養(yǎng)精種玉湯乃清代山西太原府名醫(yī)傅山所創(chuàng)，出自傅青主女科，原為 治療 身瘦不孕，后經(jīng)多年來臨床醫(yī)家們的反復實踐與錘煉，現(xiàn)已演繹成為治療不孕癥的基礎方。養(yǎng)精種玉湯廣泛用于種子期,其藥效已較為肯定,但其臨床運用安全性研究至今未見詳細報道，并缺乏臨床運用后安全性流行病學調(diào)查資料。鑒于此，本研究通過其不同劑量對CHL細胞株體外染毒，進行遺傳毒性測定,以期獲得其繼藥效學之后的臨床前毒效學資料，為其種子期合理和安全應用提供實驗學依據(jù)。 1  材料與儀器 1.1

6、0; 藥液制備對所需中藥材的來源及品種進行鑒定，篩選優(yōu)質(zhì)正品，原料經(jīng)品種鑒定無誤后，再進行挑選和洗凈，然后炮制、切片、烘干、粉碎。嚴格按照經(jīng)典處方比例用量配備，采用制備工藝如下： 取經(jīng)加工炮制的標準中藥飲片（白芍、山茱萸）用70%乙醇回流提取2次，1 h/次，合并提取液濾過，回收乙醇;其余藥與白芍、山茱萸藥渣混合，水液煎煮2次，1.5 h/次，合并濾液，濾過濾液濃縮至相對密度為1.11.2（5060），加入乙醇使醇含量達65%，冷藏24 h，醇液濾過，濾液回收乙醇，至無醇味； 以上兩液合并，冷藏放置，視無沉淀析出； 添加蒸餾水，調(diào)pH值至6.57.0, 并調(diào)整至相當于含生藥2 g/ml； 精濾

7、、灌封、滅菌即得。1.2  細胞株 中國 倉鼠肺細胞（CHL）由中國藥品生物制品鑒定所提供。由液氮冷凍保存。采用細胞培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)液補加10%胎牛血清，在37、5%CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。1.3  試劑與儀器HAM F12培養(yǎng)基：GIBCO公司出品；胎牛血清：北京元亨金馬出品；DMSO：北京化學試劑公司出品；天平：瑞士METTLER TOLEDO  AL204DU-IC型；生物安全柜：美國Labconco  DELTA型；恒溫搖床：上海智城ZHWY-200B型。1.4  陽性對照劑間接誘變劑為環(huán)磷酰胺（Cyclophosphomide）

8、，代號CP，來源于上海華聯(lián)制藥有限公司/011204，外觀為白色粉劑，用生理鹽水配制成20 mg?ml-1母液，現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋成50 g?ml-1應用液。直接誘變劑為絲裂霉素C(Mitomycin C),代號MMC，來源于Kyowa Hakko Kogyo Co.ltd/333AJG，外觀為灰色粉劑，用生理鹽水配制成200 g?ml-1母液，現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋成25 g?ml-1應用液。 2  方法 2.1  S9活化系統(tǒng)制備取體質(zhì)量160200 g的健康Sprague-Dawley SPF/VAF大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)200

9、7-0001。腹腔注射多氯聯(lián)苯玉米油溶液，5 d后頸椎脫臼處死，制備肝勻漿。勻漿以9 000 g離心取上清液(S9)分裝,液氮冷凍保存;臨用時，取S9進行S9混合液配制。2.2  分組依據(jù)預實驗采用MTT方法觀察養(yǎng)精種玉湯不同濃度對CHL細胞生長的抑制作用結(jié)果，設3個劑量組濃度分別為5 000，1 500，1 250 g/ml。同時設溶劑對照、S9對照及陽性誘變劑對照。2.3  操作步驟及檢測指標取處于對數(shù)生長期的CHL細胞培養(yǎng)體系，正常對照或3個劑量組分別加入相應劑量的應用液，加樣體積均為40 l，陽性對照按照各自的濃度要求加入適當體積的溶液。其中，在-S9mix的條件下

10、，不同濃度藥物的作用時間各取兩個時間點，即24 h和48 h；+S9mix 時藥物作用于細胞的時間為6 h，然后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。終止培養(yǎng)前2 h秋水仙堿處理; 0.25%胰蛋白酶液消化;離心管離心;低滲液低滲;固定液固定;離心,重復1次;滴片,酒精燈上干燥;10%Giemsa 染色制片。指標檢測，每個濃度組至少觀察100個中期分裂相，在油鏡下分別記錄細胞染色體的數(shù)量變化及畸變類型，然后根據(jù)畸變細胞數(shù)算得畸變率。結(jié)構畸變包括染色體型畸變和染色單體畸變，畸變類型包括斷裂、缺失、易位、雙著絲點和環(huán)等。2.4  統(tǒng)計學分析采用SAS 9.13版軟件由 計算 機完成，計

11、數(shù)資料進行2檢驗。 3  結(jié)果 直接誘變劑絲裂霉素C（MMC）在25 g/ml濃度下,CHL細胞染色體畸變率顯著增高至60%，間接誘變劑環(huán)磷酰胺（CP）在50 g/ml濃度下，并在S9活化條件下染色體畸變率顯著增高至70%，而溶劑對照組在+S9及-S9兩種測試條件下,染色體結(jié)構畸變率均小于5%，且陽性對照與溶劑對照相比具有統(tǒng)計學意義上的增加（P0.01）。養(yǎng)精種玉湯劑量在1 2505000 mg/ml不同濃度范圍內(nèi)，在S9活化和非活化兩種測試條件下，無論24 h或48 h收獲CHL細胞,進行染色體畸變分析，染色體畸變率也在正常范圍，并與溶劑對照比較無顯著性差異(P0.05)。見表1。

12、表1  養(yǎng)精種玉湯對CHL細胞染色體畸變影響（略） 4  討論 染色體是一條雙螺旋結(jié)構的DNA鏈和比較松散地結(jié)合在蛋白質(zhì)上的復合物。它是遺傳單位基因的載體，具有獨特的形態(tài)和結(jié)構，當受到外界誘變物作用時易出現(xiàn)損傷，即在形態(tài)及結(jié)構上發(fā)生畸變。染色體畸變的機制比較復雜，一般認為，誘變物主要作用于細胞分裂周期G1期，此時染色體尚未復制，易導致染色體損傷產(chǎn)生畸變。由于CHL細胞株的不同世代之間，在細胞周期時間和克隆形成率等參數(shù)上沒有明顯差異，便于控制實驗條件，且不受動物體內(nèi)營養(yǎng)及生理、免疫狀態(tài)影響，因而能定量研究，重復性也好，且能傳代保存，便于進行形態(tài)學和超微結(jié)構等觀察，并進行細胞化

13、學、生物化學等分析。CHL染色體畸變試驗是體外細胞培養(yǎng)染色體正向突變實驗1，不但能判定染色體數(shù)目異常，尚能判定染色體結(jié)構變化。養(yǎng)精種玉湯作為助孕名方，備受歷代醫(yī)家所重視。本文采用CHL細胞培養(yǎng)方法，直接誘變劑MMC在-S9條件,CHL細胞染色體畸變率顯著增高至60%，間接誘變劑CP在+S9條件下染色體畸變率顯著增高至70%，而溶劑對照在+S9及-S9兩種測試條件下,染色體結(jié)構畸變率均小于5%，且陽性對照與溶劑對照相比具有統(tǒng)計學意義上的增加（P0.01），這說明試驗系統(tǒng)可信。對養(yǎng)精種玉湯設5 000，2 500，1 250 g/ml不同劑量對CHL細胞進行體外染毒，結(jié)果無論24 h及48 h收集細胞，并在S9活化與非活化兩種測試條件下，進行染色體畸變分析，各劑量組、溶劑對照染色體畸變率均在正常范圍，說明其在本實驗所確定的5 000 g/ml以下，初步認為無誘發(fā)CHL染色體畸變作用。不過，染色體畸變試驗主觀因素大，尤其采樣時間的把握對試驗成敗有較大影響，需特殊訓練的專業(yè)技術人員，因此，