半胱氨酸蛋白酶與消化系腫瘤化療

1、半胱氨酸蛋白酶與消化系腫瘤化療作者：馮斌時間：2007-11-23 10:15:00 摘要 半胱氨酸蛋白酶（Caspases）激活級聯(lián)反應在凋亡調(diào)控中占核心作用，它涉及2條主要途徑：死亡介導途徑和線粒體依賴途徑。不同的凋亡刺激信號經(jīng)各自特定途徑的起始不同的Caspases級聯(lián)反應，進而激活下游的效應Caspases，誘發(fā)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)有些細胞毒化療藥物通過半胱氨酸蛋白酶而誘導消化系腫瘤細胞凋亡。目前，通過調(diào)節(jié)Caspases的活性促使癌細胞凋亡是腫瘤治療研究中一個值得探索的領域。 關鍵詞 半胱氨酸蛋白酶；細胞凋亡；消化系腫瘤；化療 近年來，隨著研究的深入，在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種半胱氨酶蛋

2、白酶。這些結構特點相似的酶構成了一個蛋白酶家族，稱之為Caspases家族。它是執(zhí)行細胞凋亡的主要酶類。這些蛋白酶在細胞凋亡中的作用及機制和在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療中的意義，是腫瘤學基礎及臨床研究領域的熱點之一。本文就Caspases與細胞凋亡、凋亡調(diào)控基因、消化系腫瘤及化療的關系作一簡要綜述如下。 1 Caspases家族概述 1993年Yuan等發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲的Ced-3基因與哺乳動物細胞ICE（interleakin-1 converting enzyme）存在功能和序列上的高度同源，與ced-3一樣ICE高表達可導致嚙齒動物成纖維細胞凋亡。目前在哺乳動物細胞中已發(fā)現(xiàn)有14種ICE/c

3、ed-3蛋白酶家族成員1，命名為半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific protease），簡稱Caspases，有學者稱之為“半胱天冬酶”。它們具有相似的氨基酸序列、結構和底物特異性。許多Caspases在哺乳動物的細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。細胞凋亡是從內(nèi)外多因子復雜的相互作用誘導產(chǎn)生凋亡信號，傳遞至Caspases，并使其活化為開始，以蛋白底物裂解、細胞解體為結局，從而使細胞凋亡得以完成。因此，對于Caspases的深入研究將對其依賴的細胞凋亡相關腫瘤和疾病有可能提供治療的又一新靶點，從而為基因治療提供新的途徑。 1.1 Caspases的生物

4、學特性 Caspases最初表達為蛋白酶的形式，基本結構包括：N端結構域參與酶功能激活調(diào)節(jié)及大、小亞基提供與底物結構及催化所需的氨基酸。Caspases可專一、高效地特異性水解一系列的蛋白底物，并導致蛋白質功能 喪失或改變2。Caspases按功能分為啟動子Caspases即Caspases-2、Caspases-8、Caspases-9、Caspases-10和效應子Caspases，即Caspases-3、Caspases-6、Caspases-7。效應子被啟動激活，執(zhí)行最終的凋亡效應，Caspases-3（CPP32）是最重要的細胞凋亡執(zhí)行者之一3。而啟動子Caspases則被特定的結合

5、蛋白、其他Caspases及本身激活4。這些結合蛋白質將凋亡信號和Caspases聯(lián)系起來，決定2種基本凋亡途徑：線粒體途徑和死亡受體途徑。最近報道的第3條途徑是小鼠體內(nèi)的Caspases-12介導內(nèi)質因特異性凋亡5。 1.2 Caspases與調(diào)控基因 p53基因 p53基因作為一種轉錄因子能促進或抑制很多與細胞周期及凋亡相關基因的表達（如p21和Bax等）。因此，p53可通過直接或間接調(diào)節(jié)凋亡通路中多個關鍵因子而調(diào)控凋亡。Burns6的研究發(fā)現(xiàn)人腫瘤細胞過表達p53能誘導該細胞凋亡，而特異性抑制劑分別抑制了Caspases-8及Caspases-9后均能抑制這種p53依賴的凋亡。Fuchs

6、等發(fā)現(xiàn)放射損傷引起的小鼠胸腺細胞凋亡時，p53依賴于Caspases-3的活化。但p53亦能抑制昆蟲、線蟲、哺乳動物細胞的凋亡，p53阻斷細胞凋亡機制在于與Caspases家族成員（包括Caspases-1、Caspases-2、Caspases-3、Caspases-4）形成p53-Caspases復合體，從而抑制Caspases催化活性。 Bcl-2家族 Bcl-2家族迄今為止發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族同源蛋白不少于15種，均含有1種以上Bcl-2家族共同源序列（BH1-BH4）。按結構功能不同分為前凋亡蛋白（preapoptotic protein）和抗凋亡蛋白（antiapoptotic p

7、rotein）。Bcl-2或其他抗凋亡蛋白過表達使許多本可致PT孔（permeability transition pore，PTP）開放，細胞色素C及凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）釋放的刺激失效，Caspases活化降低，從而抑制凋亡；而前凋亡蛋白（又稱凋亡蛋白）Bax過表達導致線粒體跨膜電位缺失及細胞色素C釋放，導致Caspases活化增強，促進凋亡。另外，Bcl-2C末端產(chǎn)物能觸發(fā)細胞凋亡，裂解產(chǎn)物進一步激活下游的Caspases，并導致Caspases級聯(lián)反應放大。 Cmyc基因 Cmyc基因是調(diào)控細胞增殖的重要基因，其表達產(chǎn)物Cmyc蛋白是

8、一種轉錄因子。在Cmyc介導的細胞凋亡過程中，可見Caspases-3進入活化狀態(tài)，當其選擇性抑制時，能部分抑制Cmyc誘導的細胞凋亡，說明Caspases蛋白酶家族，尤其是Caspases-3參與了Cmyc介導的細胞凋亡途徑7。 此外，還有一系列蛋白稱為凋亡抑制因子（inhibitors of apoptosis，IAP），具有直接阻止凋亡作用，IAP與Caspases蛋白酶結合可使后者失活。雖然其抑制目標還不清楚，但在體外實驗中可抑制Caspases-3和Caspases-7；CrmA亦能抑制某些啟動性Caspases，抑制細胞凋亡發(fā)生；TGF能阻止神經(jīng)鞘氨醇誘導的HL-60細胞中Casp

9、ases-3活化，抑制細胞凋亡。以上說明各不同調(diào)控基因與Caspases關系密切，且影響Caspases蛋白酶的活化，進而促進或抑制細胞凋亡。 2 Caspases與細胞凋亡 1972年Kerr等8根據(jù)細胞形態(tài)學特點，首次提出細胞凋亡（apoptosis）這一概念。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡（programmed cell death，PDC），是一種基因控制的細胞自主性死亡過程。它是多細胞生物體內(nèi)的一個重要生命征象，既出現(xiàn)在個體發(fā)育過程中，也出現(xiàn)在正常生理狀態(tài)或疾病中；既在體內(nèi)發(fā)生，也出現(xiàn)在體外培養(yǎng)物中。細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學改變。 2.1 形態(tài)學改變 細胞凋亡涉及單個細胞成為非同步發(fā)生

10、的一小部分細胞。先為單個細胞與周圍細胞分離，細胞皺縮、胞質凝縮、細胞器聚集、核染色逐漸濃集。以后胞核固縮、碎裂，細胞下陷包裹碎片和細胞器，形成包膜完整的凋亡小體（apoptotic bodies）。凋亡小體很快被鄰近的細胞吞噬降解。 2.2 生物化學改變 （1）鈣離子和蛋白激酶改變：細胞內(nèi)Ca2+的堆積和重新分布，細胞核內(nèi)Ca2+增多，激活核酸內(nèi)切酶的活性；（2）核酸內(nèi)切酶激活把DNA降低成180200堿基對倍數(shù)的核苷酸片段，呈梯狀電泳現(xiàn)象；（3）組織谷氨酰胺轉移酶的積累并激活；（4）細胞骨架如肌動蛋白的變化；（5）細胞表面糖鏈、植物血凝素與玻連蛋白的受體增加，磷酯酰氨酸的外露可改變細胞表面的

11、生化特性。隨著對細胞凋亡的研究深入，目前學者們認為Caspases是細胞凋亡機制中重要的效應因子之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)14種Caspases家族成員，其中至少2/3的Caspases與細胞凋亡相關并參與多種與凋亡有關的機體生理性或病理性過程。 3 Caspases與消化系腫瘤 以往對腫瘤的研究，多認為腫瘤細胞無限增殖是腫瘤形成的關鍵。近年來，隨著對細胞凋亡研究的深入，人們越來越重視細胞凋亡與腫瘤的關鍵，認識到組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定實際上是細胞增殖和死亡之間的平衡?，F(xiàn)認為在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段均存在細胞凋亡，與Caspases家族有著密切關系。消化系腫瘤亦是如此。Hoshi等9研究33例人胃癌組織發(fā)現(xiàn)，Caspases-3的表達較正常組織明顯降低，提示Caspases介導細胞凋亡的異常降低可能與胃癌的發(fā)生密切相關；國內(nèi)林萬隆等10對50例胃癌組織中Caspases-3和bclx2表