抗FMDV基因疫苗的研究進展.docx

1、第39卷第4期西南民族大學學報-自然科學版JournalofSouthwestUniversityforNationalitiesNaturalScienceEditiondoi:10.3969/j.issn.)003-4271.2013.04.02抗FMDV基因疫苗的研究進展嚴亨秀，唐冬梅，付麗新(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，成都610041)摘要：口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的豬、牛、羊等偶蹄動物一種高接觸性傳染病.口蹄疫一旦爆發(fā)和流行，會使家南生產(chǎn)性能降低，給養(yǎng)殖戶造成重大損失，給公共衛(wèi)生造成重大的影響.隨著弱毒苗禁用和滅活苗的戒少使用，新型疫苗的研究成為熱點.自1990年首次出現(xiàn)基因疫

2、苗的研究報道之后、及因疫苗已經(jīng)成為疫苗研究領(lǐng)域中的一大熱點，因此該文對近年來國內(nèi)外口蹄疫基因疫苗研究的主要進展進行絳述：關(guān)鍵詞：口蹄疫：FMDV;基因疫苗中圖分類號：S852.65;S855.3文獻標識碼：A文章編號：1003-4271(2013)04-0495-06口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)所引起的牛、羊、豬等偶蹄動物的一種急性、熱性傳染病.該病具有傳播速度快、流行范圍廣、對畜牧業(yè)危害較大的特點.該病一旦發(fā)生爆發(fā)流行，會使家畜生產(chǎn)性能降低，給公共衛(wèi)生造成重大的影響.我國將此病規(guī)定

3、為一類動物傳染病,世界動物衛(wèi)生組織也將其列為A類傳染病.世界各國都十分重視對該病的防控.我國是發(fā)病國之一，主要流行0型、A型、Asial1型口蹄疫.目前我國防治口蹄疫主要采取綜合防治措施：以疫苗計劃免疫為主同時輔以疫區(qū)封鎖和撲殺.傳統(tǒng)的口蹄疫疫苗主要有弱毒疫苗和滅活疫苗.但由于口蹄疫病毒易發(fā)生變異，弱毒疫苗遺傳性不確定，所以從上個世紀70年代開始，弱毒苗已經(jīng)停止研究與應用.同時由于滅活疫苗的潛在風險，歐盟于1992年宣布停用FMDV滅活苗.因此，研制安全、高效的新型疫苗已成為未來疫苗發(fā)展的趨勢，其中基因疫苗作為一種新型疫苗成為研究的熱點.本文就目前豬FMD基因疫苗國內(nèi)外進展作些探討.1 FMD

4、V結(jié)構(gòu)口蹄疫的病原為口蹄疫病毒(FMDV),該病毒屬于單股正鏈無囊膜RNA病毒，是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的成員.FMDV共有7個血清型，根據(jù)其核酸同源性大小又分為兩個群.第1群分為O、A、和AsiaI型；第二群分為SAT1、SAT2、SAT3.目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FMDV至少擁有80個亞型，且各血清型之間也存在著一些交叉免疫的現(xiàn)象.FMDV的病毒粒子包括衣殼和RNA兩部分.在病毒的中心是一條單鏈的正鏈RNA,大約由8000個堿基組成，是病毒感染和遺傳的基礎；周圍包裹著的蛋白質(zhì)決定了病毒的抗原性、免疫性和血清學反應能力；病毒的衣殼為對稱的20面體.其由VP1、VP2、VP3、VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白

5、組成網(wǎng).由于結(jié)構(gòu)蛋白突顯在病毒粒子表面，承受了較大的選擇壓力，而且VP1蛋白暴籍在病毒粒子表面部分多，因此VP1基因容易發(fā)生變異.這些變異常常導致毒株的抗原性以及毒力的變化，給口蹄疫防治造成了很大困難.VP1代表了口蹄疫病毒的免疫原性以及遺傳性方面的特點，因此在決定病毒的抗原性方面有著重要作用.經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在口蹄疫O型，有位于VP12140、141160、200213位氨基酸上的3個中和性抗原.其中141160及200213位氨基酸為B細胞的表位，能引發(fā)相關(guān)的體液免疫反應.從口蹄疫病毒衣殼蛋白中分離出VP1可以誘導動物產(chǎn)生中和性抗體.研究者們開始嘗試用病毒衣殼蛋白上的相關(guān)抗原表位來設計基因工程

6、抗原，并用來檢測和預防疾病同.收稿日期：2013-05-21作者簡介：嚴亨秀(I97I-),女,副教授，博士，Email:yanhengxiu基金項目:四川省科技廳項目：2011JYOO33;西南民族大學研究生學位點建設項目(2011XWD-S0906)2 FMDV基因疫苗基因疫苗是將需要的外源基因克隆整合到用作真核表達的栽體上，再把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到動物機體內(nèi)，使外源性基因在動物機體內(nèi)得到相關(guān)表達，并產(chǎn)生抗原、激活機體的免疫反應叫疫苗原理是：質(zhì)粒DNA本身沒有或者有微弱的免疫原性，不能夠引起相關(guān)的免疫應答，但是在被感染宿主細胞內(nèi)，模擬病毒感染，從而誘發(fā)有用的應答反應.同傳統(tǒng)疫苗相比，基因疫苗具有很

7、多優(yōu)點，比如無感染性，較好的熱穩(wěn)定性，易操作等“I.在早期研究中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒DNA能夠刺激并產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應.質(zhì)粒中所包含的相關(guān)抗原基因被翻譯后，提呈給機體免疫系統(tǒng)時，可以誘導B細胞和T細胞免疫反應IW.同傳統(tǒng)的疫苗相比，基因疫苗能夠引起廣泛的免疫應答，包括先天免疫、體液免疫和細胞免疫Mm】.同時，基因疫苗擁有多種免疫方式，包括注射免疫、基因槍法和電穿孔法等，當以基因槍法或者電穿孔法進行免疫時，往往產(chǎn)生較強的體液免疫；而進行肌肉注射、皮內(nèi)注射、腹腔注射時則會產(chǎn)生較強的細胞免疫口蹄疫基因疫苗一般是保護性抗原基因和真核表達質(zhì)粒載體這兩部分組成.保護性的抗原基因可以是：能編碼VP1

8、的抗原位點上的表位口-24】，單個基因(如VP1)四)，一組基因I2&29,也可以是編碼基因和有協(xié)同保護作用的基因連在一起列.用作口蹄疫基因疫苗的真核表達質(zhì)粒載體有多種，而研究者通常選擇PCDNA3.I系列.從結(jié)構(gòu)上看,pCDNA3.1具有大腸桿菌的Ori位點，使它能在原核細胞中進行大量復制，因而目的基因可以隨宿主細胞的分裂跟隨胞漿遺傳給新生子細胞而保證目的基因的穩(wěn)定表達；它是一種高效的真核表達質(zhì)粒，含有T7多克隆位點，以便于外源基因插入；包含有高效增強子SV40,這種增強子是能促進基因轉(zhuǎn)染活性的調(diào)控元件,在目的基因前多克隆位點前裝有功能很強的基因啟動結(jié)構(gòu)T7PCMV,這樣使得目的基因的表達得

9、以保證.3 FMDV基因疫苗的發(fā)展抗FMDVDNA疫苗的研究開始于20世紀80年代末和20世紀90年代初【尬31).Wolff時等將質(zhì)粒DNA接種于小鼠肌肉，取得了較好的免疫效果.Ward時等首次將FMDV血清型A12的cDNA連接在真核表達質(zhì)粒載體上,轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后產(chǎn)生病毒粒子.Beard,54等人首次報道了FMD病毒基因疫苗免疫小鼠后能產(chǎn)生抗FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的特異性抗體，用其免疫豬后也誘發(fā)了較強的免疫反應，證實了FMD病毒基因疫苗能引起特異性免疫應答反應HuangH1351等，利用豬IgG序列融合蛋白基因構(gòu)建的基因疫苗，在不同的早、晚期啟動子控制下，免疫豚鼠均均可誘導中和抗體

10、的產(chǎn)生和脾細胞的增殖.在口蹄疫基因疫苗的研究中，研究者們最初僅選擇編碼VP1表位的核酸區(qū)段進行免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表位所誘導的免疫反應持續(xù)時間較短且表現(xiàn)很弱.WongNI等嘗試著克服這一點，將FMDVVP1140160和200213位氨基酸殘基編碼區(qū)基因同豬【gG的重鏈恒定區(qū)編碼基因相連，構(gòu)建了一個真核表達質(zhì)粒(pCElS),然后在小鼠(腹部)和豬(耳部、腿部)分別進行免疫.免疫腹部的小鼠和免疫耳部的豬都產(chǎn)生了體液免疫和細胞免疫，并在攻毒中獲得全部保護，但在腿部進行免疫的豬沒有被保護.趙凱、陳光輝38】等首先缺失掉IgGH鏈基因中的抗原互補決定區(qū)(CDR3區(qū))，再將所剩兩個基因片段分別與質(zhì)粒pBlu

11、escript口SK(+)和質(zhì)粒pBluescriptHKS(+)相連接.其中與質(zhì)粒pBluescriptflSK(+)相連接的片段再與編碼FMDVVP1的141160和200213位禽基酸殘基所構(gòu)成的串聯(lián)片段相連接.然后將之前的片段和串聯(lián)片段切下與真核表達載體pET28b再次連接，構(gòu)建出新的表達質(zhì)粒pET28b-FH,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，表達出64kD分子量的蛋白質(zhì).實驗證明這種蛋白抗O型FMDV活性；將該種蛋白通過肌肉注射豚鼠和豬.在攻毒實驗中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒pET28b-FH對豚鼠產(chǎn)生了保護作用;Benvenisti1281等將FMDV結(jié)構(gòu)基因Pl和非結(jié)構(gòu)基因2A、3CD進行串聯(lián)后，再連接上腦

12、心肌炎病毒的核格體基因.通過檢測發(fā)現(xiàn)了在機體外有病毒蛋白表達，再利用基因槍將產(chǎn)生的蛋白注射到豬皮膚中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分豬獲得了抵抗FMDV強毒攻擊的能力.隨著研究的進行，一些學者開始關(guān)注一些細胞因子的作用.比如IL-2、1L.1、IL-6、IL.15、IL9、IL-18、OX40L和4-IBBL(屬于TNF受體家族)，但只有IL-2和IL18在自然易感動物進行了實驗刊.Wong等用400瞄pCEIS和400昭pCEIS-IL-2分別來免疫豬仲，所有組都產(chǎn)生了相同的B細胞免疫應答，但是T細胞免疫在PCEIS-IL-2組較強，且這組中的所有豬都在攻毒中獲得全部保護.以上早期研究中，盡管學者們所用的免疫

13、方案簡單有效，但基因疫苗所產(chǎn)生的保護效率還很有限.Shieh1251將基因免疫與亞單位疫苗聯(lián)合起來進行免疫，希望以此增強疫苗的免疫效果.首先用負載口蹄疫病毒基因VP1的質(zhì)粒免疫鼠，接下來用VP1多肽偶合物(P292KLH)加強，免疫后的小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體.這些抗體具有中和口蹄疫病毒的活性.在Shieh的研究基礎上，Jin1451等改進免疫方案，用FMDV基因疫苗進行初次免疫后,FMDVVP1蛋白加強免疫，比較該種免疫方案和傳統(tǒng)基因疫苗方案的不同.結(jié)果顯示免疫后的小鼠和綿羊均獲得很強的體液免疫和細胞免疫.人們發(fā)現(xiàn)增強免疫、聯(lián)合免疫等方式都有刺激免疫增強的作用.基因疫苗中抗原肽的多樣性可能是部分

14、基因疫苗免疫效果不佳的原因所在，因此一些研究人員開始研究針對B細胞和T細胞特定表位的FMDV基因疫.Zhang等研究了FMDV多種結(jié)構(gòu)表位組合的基因疫苗作用，包括FMDV的五個結(jié)構(gòu)位點：SG(sites1,2,4,3,5,VP1T-cellepitope);N4(sites1,2,5,1T-cellepitope);N51(sites2,3,4,VP1T-cellepitope);T51(sites2,5,VP1T-cellepitope);和51(sites1and5),以SG、N4和T51為抗原的基因疫苗能誘發(fā)顯著的抗FMDV和抗體和脾細胞增殖，表明基因疫苗中的抗原位點應該來自VP1的1,

15、5區(qū)和T細胞表位.Guo,47)等研究在缺失其他免疫刺激物的情況下，將一種T細胞表位(位于非結(jié)構(gòu)蛋白3D上)的內(nèi)含物加入免疫，觀測其能否提高臨床保護.用600昭包含VP1,2A和3C(pCDNA.3.1P12X3C)的質(zhì)粒DNA和1.5mg純化3D免疫豚鼠，結(jié)果都產(chǎn)生了細胞免疫，但所產(chǎn)生的抗體水平普遍較低.攻毒后，對豚鼠不能產(chǎn)生保護.值得一提的是用不含3D的pCDNA.3.1P12X3C進行免疫時，產(chǎn)生了較高的抗體水平和臨床保護.進入21世紀，人們開始關(guān)注DNA疫苗的載體、如何更佳趨化免疫細胞、以及限制病毒復制等問題.如果這些問題得到很好的解決，將可以大大降低DNA的用量和它的潛在風險.人們已

16、開始嘗試在不同部位免疫、用PLG包裹DNA、陽離子脂質(zhì)體、電穿孔法、佐劑等方法提高免疫效力.也有學者直接用免疫增強劑來提高FMDV基因疫苗的活力，包括tween80、丁哌卡因、BCG、C3d、殼聚精、板蘭根提取物、CD40等甄罰；盡管大部分佐劑被證明有加強體液免疫和細胞免疫的作用，但是到目前為止，這些佐劑還未在自然易感動物中進行測試，其潛力仍待探索.Niborski和Li等用PLG微粒，陽離子微脂囊，明磯和羊的GM.CSF分別與CedilloBarron等使用的質(zhì)粒結(jié)合免疫研究其免疫效果阡叫同時他們也研究接種部位和劑量對免疫效果的影響.研究顯示，當以1.2mgPLG微粒負載DNA皮注或肌注免疫

17、綿羊時，產(chǎn)生了最好的體液免疫和細胞免疫，在進行天然氣溶膠攻毒時，綿羊獲得全部保護.Li等發(fā)現(xiàn)，對羊進行皮注和肌注結(jié)合免疫時產(chǎn)生了很強的免疫反應，這是首次考慮由接種部位不同而產(chǎn)生不同的免疫效果，對今后評估基因疫苗的有效性具有重要啟示作用.Wang1541等探究使用包含多種疾病編碼基因的基因疫苗免疫能否提高免疫應答.使用三種質(zhì)粒：含。型FMDV5個表位的質(zhì)粒，含偽狂犬病毒株(Ea)的gD基因的質(zhì)粒，豬高熱病病毒的E2基因的質(zhì)粒.分別以150昭DNA進行電穿孔法免疫后都獲得了體液免疫和細胞免疫.但當每種劑量減少到150熙再結(jié)合進行免疫時，抗FMDV的體液免疫和細胞免疫被抑制.這啟示我們應該仍需進一步

18、研究抗FMDV的基因疫苗能否與其他疫苗一起使用.Lif551等用初免一加強法：先以1.2mgpcDNA3/P12A3C3D質(zhì)粒和800昭表達pGM-CSF的質(zhì)粒進行初免,再以滅活146SFMDV抗原和重組3D蛋白構(gòu)建的結(jié)合蛋白來加強免疫.結(jié)果在豬上產(chǎn)生了中和抗體，并在攻毒中得到保護.這次免疫中使用相對較高的DNA劑量和滅活的FMDV抗原進行加強.Borrego1561等將來自pCMV-BTT的表位同APCH1的單鏈可變區(qū)結(jié).Ganges等用pCMV-BTT和pCMV-spBTT分別免疫豬，并進行攻毒.結(jié)果除了一只注射了pCMV-spBTT的豬檢測到抗體外，其余豬上均未檢測到中和抗體.Borre

19、go1571等按Ganges的方法使用相同DNA劑量進行實驗，獲得了不同結(jié)果.在研究中，有兩只豬獲得全部保護，另有兩只獲得部分保護(臨床癥狀減輕).另外Ba*】將結(jié)構(gòu)基因PI和一種核酸依賴型RNA聚合蛋白D3進行重組結(jié)合，構(gòu)建質(zhì)粒并免疫小鼠，結(jié)果獲得了相應的體液和細胞免疫應答.WangG【列等人用包含編碼FMDV衣殼蛋白和牛IL.6基因的陽離子PLGA納米顆粒作為鼻內(nèi)載體免疫大鼠后，結(jié)果獲得較強的細胞免疫.4基因疫苗的應用及展望基因疫苗相對于傳統(tǒng)疫苗有很多優(yōu)點，比如不會發(fā)生活體病毒感染，不會對病毒非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生一些免疫反應等，但用于實踐的疫苗還不多，主要是由于此類新型疫苗的免疫原性較弱，需要大

20、量應用或者急性重復注射.因此，研究人員采用了很多方法試圖來解決這些問題，比如將多肽與T細胞表位或折B細胞表位連接，增加多肽拷貝數(shù)，增強疫苗在機體內(nèi)部的免疫反應等I60叫.基因疫苗自研究以來始終伴隨著各種質(zhì)疑.例如基因有可能會整合到宿主的基因中，外源抗原的持續(xù)表達也許會產(chǎn)生不良后果，質(zhì)粒DNA上所攜帶的抗原基因不可進行調(diào)控，質(zhì)粒DNA有可能會誘導自身免疫反應等安全性問題.但在目前實際研究中，還未發(fā)現(xiàn)上述可能情況，這也有可能是當前的研究還未顯現(xiàn)其不安全的狀況.所以，疫苗的安全性仍是研究者們需要關(guān)注的重要方向.隨著對基因疫苗的研究越來越多，如何將科研與臨床應用相結(jié)合，如何在實際中推廣，仍然面臨很多困

21、難.研究者們應加強國內(nèi)外交流和溝通，取長補短，促進畜牧業(yè)的發(fā)展.參考文獻：1 王明俊.獸醫(yī)生物制品判M.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社、1997.2 SAMUELAR,KNOWLESNJ.Foot-and-mouthdiseasetypeOvirusesexhibitgeneticallyandgeographicallydistinctevolutionarylineagcs(topotypes)J.JGenVirol,2001,82:609-621.3 朱晶晶.魏玉榮，符子華.口蹄疫病毒VPI基因研究進展J.動物醫(yī)學進展,2008,29(7):75-78.4 DoelTR.FMDvaccines。.

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