實(shí)驗(yàn)六POD同工酶提取分離活性測(cè)定定稿

1、實(shí)驗(yàn)六POD同工酶提取分離活性測(cè)定定稿小麥幼苗過(guò)氧化物酶小麥幼苗過(guò)氧化物酶同工酶的提取、分離同工酶的提取、分離實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 七七學(xué)時(shí)：學(xué)時(shí)：9 9馮麗、石峰1 1、掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和方法；、掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和方法；2 2、掌握同工酶的概念；、掌握同工酶的概念；3 3、掌握實(shí)驗(yàn)試劑的配制、掌握實(shí)驗(yàn)試劑的配制 。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂?、?shí)驗(yàn)?zāi)康模?1 1、同工酶和電泳概念：同工酶和電泳概念： 2 2、影響電泳的主要因素：影響電泳的主要因素： 3 3、聚丙烯酰胺凝膠電泳（、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE） 4 4、聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)：聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)： 5 5

2、、凝膠的質(zhì)量決定因素：、凝膠的質(zhì)量決定因素： 6 6、不連續(xù)、不連續(xù)PAGEPAGE的原理：的原理： （1 1）三個(gè)不連續(xù)性的表現(xiàn)：三個(gè)不連續(xù)性的表現(xiàn)： (2) (2) 不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)：不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)： （3 3） 濃縮效應(yīng)產(chǎn)生的原因：濃縮效應(yīng)產(chǎn)生的原因： 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理: : 1、同工酶和電泳概念： （1 1）同工酶指催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分）同工酶指催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。 同工酶與生物的遺傳，生長(zhǎng)發(fā)育，代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一同工酶與生物的遺傳，生長(zhǎng)發(fā)育，代謝調(diào)節(jié)及抗性

3、等都有一定的關(guān)系，如過(guò)氧化物酶在細(xì)胞代謝過(guò)程中與呼吸作用，光合作定的關(guān)系，如過(guò)氧化物酶在細(xì)胞代謝過(guò)程中與呼吸作用，光合作用，及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系，測(cè)定用，及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系，測(cè)定PODPOD活性或其同工酶，可活性或其同工酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝變化。以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝變化。 （2 2）電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身所帶電荷相反）電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理: : 由有效遷移率由有效遷移率mq/6r，則可推出：，則可推出：（1）帶電顆粒的大小和形狀：）帶電顆粒的大小和形狀： 顆粒越

4、大，電泳速度越慢，反之越快；顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；（2）顆粒的電荷數(shù)：）顆粒的電荷數(shù)： 電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；（3） 溶液的粘度：溶液的粘度： 粘度越大，電泳速度越慢，反之越快；粘度越大，電泳速度越慢，反之越快；（4）溶液的）溶液的pH值：值： 影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電 泳速度越慢，反之越快；泳速度越慢，反之越快； 2、影響電泳的主要因素： （5 5）電場(chǎng)強(qiáng)度：）電場(chǎng)強(qiáng)度： 電場(chǎng)強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反之越快；電場(chǎng)強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反之越快；（6 6）離子強(qiáng)度：）離子強(qiáng)度：

5、 離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快；離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快；（7 7）電滲現(xiàn)象：）電滲現(xiàn)象： 電場(chǎng)中，液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)；電場(chǎng)中，液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)；（8 8）支持物篩孔大?。海┲С治锖Y孔大?。?孔徑小，電泳速度慢，反之則快?？讖叫?，電泳速度慢，反之則快。 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是由丙烯酰胺單體（種區(qū)帶電泳。這種凝膠是由丙烯酰胺單體（AcrAcr）和交聯(lián)劑）和交聯(lián)劑N N，N N- -甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺（BisBis）在催化劑作用下聚合而成）在催化劑作

6、用下聚合而成的，的，AcrAcr和和BisBis在具有自由基團(tuán)體系時(shí)，就會(huì)聚合。在具有自由基團(tuán)體系時(shí)，就會(huì)聚合。 引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有兩種：引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有兩種： （1 1）化學(xué)法）化學(xué)法 （2 2）光聚合法。）光聚合法。 3 3、聚丙烯酰胺凝膠電泳（、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE） （1 1）化學(xué)聚合：）化學(xué)聚合： 引發(fā)劑是過(guò)硫酸銨引發(fā)劑是過(guò)硫酸銨(AP)(AP)，催化劑，催化劑N N、N N、N N、N N四甲基乙四甲基乙二胺（二胺（TEMEDTEMED），它的堿基催化），它的堿基催化APAP產(chǎn)生自由硫酸基，其氧原產(chǎn)生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺單體形成單體長(zhǎng)鏈?；瘜W(xué)聚

7、合形成的凝膠孔子激活丙烯酰胺單體形成單體長(zhǎng)鏈。化學(xué)聚合形成的凝膠孔徑較小，且重復(fù)性好，用來(lái)制備分離膠；徑較小，且重復(fù)性好，用來(lái)制備分離膠；（2 2）光聚合：）光聚合： 光聚合法的催化劑是核黃素（光聚合法的催化劑是核黃素（V VB2B2），光聚合形成的凝膠孔），光聚合形成的凝膠孔徑較大，且不穩(wěn)定，適于制備大孔徑的濃縮膠。徑較大，且不穩(wěn)定，適于制備大孔徑的濃縮膠。 聚合反應(yīng)：架橋物造成分枝端點(diǎn)自由基 可再延續(xù)freeradicalBisBis聚合反應(yīng)交錯(cuò)連結(jié)自由基形成（1 1）聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單體構(gòu)成的）聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單體構(gòu)成的 長(zhǎng)鏈，鏈與鏈之間通過(guò)甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起；

8、長(zhǎng)鏈，鏈與鏈之間通過(guò)甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起； （2 2）鏈的縱橫交錯(cuò)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具）鏈的縱橫交錯(cuò)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具 有分子篩的性質(zhì)；有分子篩的性質(zhì)；（3 3）網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，）網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)， 使凝膠具有抗對(duì)流的作用；使凝膠具有抗對(duì)流的作用；（4 4）長(zhǎng)鏈富含酰胺基團(tuán)，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠；）長(zhǎng)鏈富含酰胺基團(tuán)，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠；（5 5）該結(jié)構(gòu)不帶電荷，在電場(chǎng)中電滲現(xiàn)象極為微小。）該結(jié)構(gòu)不帶電荷，在電場(chǎng)中電滲現(xiàn)象極為微小。 4 4、聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)：、聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)：（1 1）凝膠度：）凝膠度： 是指是

9、指100mg100mg凝膠溶液中含有單體（凝膠溶液中含有單體（AcrAcr）和交聯(lián)劑）和交聯(lián)劑 （BisBis）的總克數(shù)，用）的總克數(shù)，用T%T%表示。表示。（2 2）交聯(lián)度：）交聯(lián)度： 是指凝膠溶液中，交聯(lián)劑（是指凝膠溶液中，交聯(lián)劑（BisBis）占單體（）占單體（AcrAcr）和交）和交聯(lián)劑（聯(lián)劑（BisBis）總量的百分?jǐn)?shù)，用）總量的百分?jǐn)?shù)，用C%C%表示。表示。 一般濃縮膠的濃度為一般濃縮膠的濃度為7.5%7.5%，分離膠的濃度為，分離膠的濃度為10%10%。 5 5、凝膠的質(zhì)量決定因素：、凝膠的質(zhì)量決定因素： （1 1）三個(gè)不連續(xù)性的表現(xiàn)：）三個(gè)不連續(xù)性的表現(xiàn)： 凝膠由上下兩層組成，

10、兩層凝膠的孔徑不同；凝膠由上下兩層組成，兩層凝膠的孔徑不同； 緩沖液離子組成及各層凝膠的緩沖液離子組成及各層凝膠的pHpH不同；不同； 在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。 6 6、不連續(xù)、不連續(xù)PAGEPAGE的原理：的原理：不連續(xù)不連續(xù)PAGEPAGE電電泳泳膠體膠體系系統(tǒng)統(tǒng)的的組組成：成：1電電泳系泳系統(tǒng)統(tǒng)pHpH膠體濃膠體濃度度緩沖緩沖液液上層上層 (負(fù)極負(fù)極)緩沖緩沖液液2 樣本溶液 3濃縮膠 6.6.7 7 4分離膠 5下下層層 (正正極極)緩沖緩沖液液 Tris-HClTris-HClTris-glycine Tris-HClTris-glycine 8.

11、3 8.08.0 8.8.9 9 8.38.3 5% 7% - - - (2) (2) 不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)：不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)： 電荷效應(yīng)：電荷效應(yīng)： 酶蛋白按其所帶電荷的種類(lèi)及數(shù)量，在電場(chǎng)作用下向一定酶蛋白按其所帶電荷的種類(lèi)及數(shù)量，在電場(chǎng)作用下向一定的電極以一定的速度泳動(dòng)。的電極以一定的速度泳動(dòng)。 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng): : 相對(duì)分子質(zhì)量或構(gòu)型不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑的分離相對(duì)分子質(zhì)量或構(gòu)型不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑的分離膠時(shí)，所受摩擦不同，受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的遷移率。膠時(shí)，所受摩擦不同，受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的遷移率。 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng): :使待分離樣品中的各組分在濃

12、縮膠中被壓縮成層。使待分離樣品中的各組分在濃縮膠中被壓縮成層。 濃縮效應(yīng)產(chǎn)生的原因：濃縮效應(yīng)產(chǎn)生的原因：（1 1）兩層膠的孔徑不同）兩層膠的孔徑不同: :酶蛋白向下移動(dòng)到兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然酶蛋白向下移動(dòng)到兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然加大，速度變慢。這樣，就在兩層凝膠交界處使待分離的酶蛋白區(qū)加大，速度變慢。這樣，就在兩層凝膠交界處使待分離的酶蛋白區(qū)帶變窄，濃度升高。帶變窄，濃度升高。（2 2）濃縮膠中產(chǎn)生不連續(xù)的電位梯度）濃縮膠中產(chǎn)生不連續(xù)的電位梯度: :在聚丙烯酰胺凝膠中用的都是在聚丙烯酰胺凝膠中用的都是Tris-HClTris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠的緩沖液，但上層濃縮膠的pHpH為為

13、6.76.7，下層分離膠的，下層分離膠的pHpH為為8.98.9。HClHCl為強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中幾乎全部電離，為強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中幾乎全部電離，ClCl布滿(mǎn)整個(gè)膠布滿(mǎn)整個(gè)膠, ,待分離的酶蛋待分離的酶蛋白加在點(diǎn)樣孔，浸在白加在點(diǎn)樣孔，浸在pH8.3Tris-pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開(kāi)始，有效泳甘氨酸緩沖液中。電泳一開(kāi)始，有效泳動(dòng)率最大的動(dòng)率最大的ClCl迅速跑到最前面，成為快離子，在迅速跑到最前面，成為快離子，在pHpH為為6.76.7條件下解離度條件下解離度僅有僅有0.10.11 1的的 甘氨酸有效泳動(dòng)率最低，跑到最后面，成為慢離子，甘氨酸有效泳動(dòng)率最低，跑到

14、最后面，成為慢離子，這樣在，快慢離子之間就形成一個(gè)不斷移動(dòng)的界面。在這樣在，快慢離子之間就形成一個(gè)不斷移動(dòng)的界面。在pHpH為為6.76.7條件下條件下帶有負(fù)電荷的酶蛋白，其有效泳動(dòng)率介于快慢離子之間，被夾持分帶有負(fù)電荷的酶蛋白，其有效泳動(dòng)率介于快慢離子之間，被夾持分布在界面附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。布在界面附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。 在濃縮膠中的三個(gè)主要作用角色：甘氨酸: pH=8.9 負(fù)電荷 pI=5.96不帶電荷Cl-1:蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(酶酶):小分子大分子 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)：分分離膠離膠濃縮膠濃縮膠樣樣本本8.96.7離子缺乏空間離子缺乏空間A AB BC C+8.0V=I/SV=I/S1

15、1、實(shí)驗(yàn)材料：、實(shí)驗(yàn)材料：小麥幼苗小麥幼苗2 2、儀器、器皿：、儀器、器皿： (1)(1)垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置 （電泳槽，玻璃板，膠條，電泳梳子，制膠架等）；（電泳槽，玻璃板，膠條，電泳梳子，制膠架等）； (2)(2)穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀； （3 3）高速冷凍離心機(jī)；）高速冷凍離心機(jī)； （4 4）電子天平；）電子天平； （5 5）電冰箱；）電冰箱； （6 6）瓷盤(pán)、微量進(jìn)樣器；）瓷盤(pán)、微量進(jìn)樣器；三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑： 3 3、試劑：、試劑： （1 1）1N HCl1N HCl：用：用12N12N的濃鹽酸來(lái)配制；的濃鹽酸來(lái)配制； （2 2）分離膠

16、緩沖液（）分離膠緩沖液（pH8.9pH8.9的的Tris-HClTris-HCl緩沖液）：緩沖液）： （3 3）濃縮膠緩沖液（）濃縮膠緩沖液（pH6.7 Tris-HClpH6.7 Tris-HCl緩沖液）：緩沖液）： （4 4）分離膠丙膠貯液（）分離膠丙膠貯液（Acr-BisAcr-Bis貯液貯液）：）： （5 5）濃縮膠丙膠貯液（）濃縮膠丙膠貯液（Acr-BisAcr-Bis貯液貯液）：）： （6 6）過(guò)硫酸銨溶液（）過(guò)硫酸銨溶液（NHNH4 4）2 2S S2 2O O8 8簡(jiǎn)寫(xiě)簡(jiǎn)寫(xiě)ApAp：（當(dāng)天配制）；：（當(dāng)天配制）； （7 7）核黃素溶液：）核黃素溶液： （8 8）電極緩沖液：（）

17、電極緩沖液：（pH8.3Tris-pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液）甘氨酸緩沖液） （9 9）40%40%蔗糖：蔗糖： （1010）pH4.7pH4.7乙酸緩沖液：乙酸緩沖液： （1111）樣品提取液：）樣品提取液： （1212）0.5%0.5%的溴酚藍(lán)：的溴酚藍(lán)：0.5g0.5g溶于溶于100ml100ml無(wú)離子水；無(wú)離子水； （1313）過(guò)氧化物酶同工酶聯(lián)苯胺染色液：）過(guò)氧化物酶同工酶聯(lián)苯胺染色液： 1g1g聯(lián)苯胺加聯(lián)苯胺加9ml9ml冰醋酸，溶解后加冰醋酸，溶解后加36ml36ml水用時(shí)加水用時(shí)加160ml160ml水水, ,加加Vc140.8mg,Vc140.8mg,加幾滴加幾滴30%

18、30%過(guò)氧化氫原液。聯(lián)過(guò)氧化氫原液。聯(lián)苯胺是致癌物質(zhì)，稱(chēng)取時(shí)應(yīng)戴手套；苯胺是致癌物質(zhì)，稱(chēng)取時(shí)應(yīng)戴手套； 1 1、貯液的配制：、貯液的配制： 2 2、凝膠的制備：、凝膠的制備： 2.1 2.1 膠板的制備：膠板的制備： 2.2 2.2 分離膠的制備：分離膠的制備： 2.3 2.3 濃縮膠的制備：濃縮膠的制備： 3 3、酶液的制備：、酶液的制備： 4 4、裝槽、點(diǎn)樣：、裝槽、點(diǎn)樣： 5 5、電泳：、電泳： 6 6、剝膠、固定、染色：、剝膠、固定、染色： 四、實(shí)驗(yàn)步驟：四、實(shí)驗(yàn)步驟： 2.1 2.1 膠板的制備：膠板的制備： 2.2 2.2 分離膠的制備：分離膠的制備： 按下表制備分離膠按下表制備分

19、離膠試劑名稱(chēng)試劑名稱(chēng)分離膠緩分離膠緩沖液沖液分離膠丙分離膠丙膠貯液膠貯液ApAp無(wú)離子水無(wú)離子水體積比體積比1 12 24 41 1取用量取用量（mlml）3 36 612123 3 膠灌至距梳子齒下端膠灌至距梳子齒下端1cm 1cm 灌畢灌畢封上一層水加速聚封上一層水加速聚合合當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時(shí)表明聚合好。當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時(shí)表明聚合好。 2.3 2.3 濃縮膠的制備：濃縮膠的制備： 按下表制備濃縮膠按下表制備濃縮膠 試劑名稱(chēng)試劑名稱(chēng)濃縮膠緩濃縮膠緩沖液沖液濃縮膠丙膠濃縮膠丙膠貯液貯液ApAp蔗糖蔗糖體積比體積比1 12 22 22 2取用量取用量1 12 22 22 2 用濾紙吸干水用濾紙吸干水倒入濃縮膠倒入濃縮膠插入梳子插入梳子封水，照封水，照光光當(dāng)膠色由無(wú)色變?yōu)槿榘咨砻骶酆虾谩．?dāng)膠色由無(wú)色變?yōu)槿榘咨砻骶酆虾谩? 3、酶液的制備：、酶液的制備： 稱(chēng)取小麥幼苗莖部稱(chēng)取小麥幼苗莖部1g 1g 加樣品提取液加樣品提取液1ml 1ml 于冰浴中研成勻漿于冰浴中研成勻漿然后以然后以2ml2ml提取液分幾次洗入離提取液分幾次洗入離心管心管