乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA的定量分析

1、乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA的定量分析                 作者：今毅 謝文 余小萍 鄭暉 【摘要】 目的：檢測乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA的含量及其p16基因5 CpG島甲基化狀態(tài)的改變. 方法：收集61例乳腺癌患者、33例乳腺良性病變患者和27例健康志愿者的血漿樣本，抽提血漿循環(huán)DNA，以SYBR green I熒光染色法行DNA定量；利用半巢式甲基化特異性PCR技術(shù)，檢測61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA和相應(yīng)癌組織p16基因5

2、CpG島甲基化狀態(tài)的改變. 結(jié)果：乳腺癌患者、乳腺良性病變患者、健康自愿者腫瘤循環(huán)DNA濃度分別為（65.0±45.3）, (19.0±9.5)和(13.0±7.3) g/L,乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA濃度顯著高于乳腺良性病變患者和健康自愿者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05). 61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA和相應(yīng)癌組織p16基因5 CpG島甲基化狀態(tài)的改變檢出率分別為44.3%和46.2%，兩者檢出率無統(tǒng)計學差別(P>0.05). 結(jié)論：血漿腫瘤循環(huán)DNA的定量有可能成為一種新的惡性腫瘤標志物. 【關(guān)鍵詞】 乳腺腫瘤 DNA 腫瘤 p16基因 甲基化

3、腫瘤標志 生物學0引言隨著近年來腫瘤細胞生物學及分子生物學的深入研究，以及分子生物學檢測技術(shù)的快速發(fā)展，外周血腫瘤標記由于檢測的方便和非侵入性己逐步替代了受到標本采集以及無法連續(xù)監(jiān)測和隨訪追蹤等諸多限制的組織學腫瘤標記. 而外周血循環(huán)DNA及其改變的分子生物學檢測正以其不可替代的優(yōu)點逐漸被人們所重視，并成為腫瘤細胞生物學及分子生物學研究中引人注目的一個亮點1-4. 循環(huán)DNA是存在于血清和血漿中的游離DNA. 近年來，日益增多的研究表明，腫瘤在生長過程中能持續(xù)釋放腫瘤細胞DNA進入外周血液. 健康人體的血清及血漿中只含有極少量的循環(huán)DNA，在炎癥及腫瘤患者外周血中循環(huán)DNA的濃度增加，伴有轉(zhuǎn)移

4、的腫瘤患者其濃度更高于早期患者5-7. 對循環(huán)腫瘤DNA的檢測可分為定性和定量兩種：前者主要檢測血清和血漿中腫瘤特異性基因的改變，后者則檢測血清和血漿的DNA總量，兩者均可反映腫瘤的存在和嚴重程度. 我們從定量（檢測腫瘤循環(huán)DNA的含量）和定性（檢測腫瘤循環(huán)DNA的p16基因5 CpG島甲基化狀態(tài)的改變）兩方面入手，對乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA含量及其p16基因5 CpG島甲基化讃乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA的定量分析歡迎您訪問范,文,家刺母謀浣辛搜芯?1對象和方法1.1對象武漢大學中南醫(yī)院婦瘤科和腫瘤科在200508/200605收治的61例乳腺癌患者，診斷均經(jīng)組織病理學證實. 33例乳腺良性病變

5、患者為本院婦產(chǎn)科同一時期收治的，排除其他病變. 27健康對照來自本院體檢中心，體檢正常，無疾病在身. QIAamp DNA Blood Midi Kit購自Qiagen公司, 熒光染料SYBR green I購自Molecular Probes公司，標準量DNA購自Invitrogen公司, Wizard DNA Purification Resin購自Promega公司, PCR擴增儀為BIORAD公司，電泳儀、凝膠成相系統(tǒng)為北京六一電子儀器設(shè)備廠, FR2200紫外投射儀與可見分析裝置為上海復(fù)日科技有限公司產(chǎn)品.1.2方法統(tǒng)計學處理: 全部資料用SPSS 11.0軟件分析，計數(shù)資料采用2檢

6、驗進行組間比較，計量資料采用非參數(shù)秩和檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義.2結(jié)果2.1血漿循環(huán)DNA濃度的檢測乳腺癌患者為（65.0±45.3） g/L, 乳腺良性病變患者(19.0±9.5) g/L, 健康自愿者(13.0±7.3) g/L. 乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA濃度顯著高于乳腺良性病變患者和健康自愿者，差異在統(tǒng)計學上有顯著性(P<0.05).2.2血漿循環(huán)DNA濃度作為乳腺癌診斷標準的敏感度及特異度應(yīng)用受試者工作特性曲線(ROC)對乳腺癌患者組和兩對照組(乳腺良性病變組、健康自愿者組)進行了分析. 采用19 g/L作為診斷乳腺癌的臨界值, 結(jié)果顯

7、示在健康人群中檢測乳腺癌的敏感度為95.1%, 特異度為88.9%, ROC曲線下面積(AUC)為0.946,95%CI為0.8760.983 (圖1). 采用22 g/L作為診斷乳腺癌的臨界值, 結(jié)果顯示在乳腺良性病變?nèi)巳褐袡z測乳腺癌的敏感度為93.4%, 特異度為66.7%, AUC為0.845, 95%CI為0.7560.912 (圖1).2.3乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA p16基因5 CpG島甲基化狀態(tài)改變的檢測為了證實血漿腫瘤循環(huán)DNA的特性,我們對61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA的p16基因5 CpG島甲基化狀態(tài)變化進行了檢測. 半巢式甲基化特異性PCR分析結(jié)果顯示: 61例乳腺癌患者

8、血漿循環(huán)DNA有27例p16基因5 CpG島甲基化, 甲基化率44.3%, 其相應(yīng)的腫瘤組織DNA有28例p16基因5 CpG島甲基化, 甲基化率46.2%, 兩者檢出率無統(tǒng)計學差別(P>0.05). 血漿循環(huán)DNA具有腫瘤特性的相關(guān)基因.3討論乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，治療上早期診斷是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié). 血中游離DNA和p16基因5 CpG島甲基化的檢測為乳腺腫瘤的早期診斷提供了一種新的簡便途徑.已證實腫瘤患者血清DNA水平大      大高于正常人8-9. 研究表明乳腺癌在發(fā)生過程中除DNA序列改變外，DNA甲基化的表遺傳性的改變早于惡性表型

9、的出現(xiàn)并且具有腫瘤的獨特性，啟動子的高甲基化是抑癌P16基因在乳腺腫瘤中失活的機制之一. 本實驗中61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA及其相應(yīng)的腫瘤組織DNA甲基化檢出率分別為44.3%和46.2%, 兩者檢出率無統(tǒng)計學差別(P>0.05). 這證明p16基因5 CpG島甲基化狀態(tài)具有腫瘤特異性，并且循環(huán)血中DNA和腫瘤讃乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA的定量分析(3)歡迎您訪問范,文,家櫓斜澩锏幕蛞恢?本實驗我們采用SYBR green I熒光染色法研究了不同組別血漿循環(huán)DNA的濃度. 結(jié)果顯示: 乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA濃度（65.0±45.3） g/L顯著高于乳腺良性病變患者(19.0

10、±9.5) g/L和健康自愿者(13.0±7.3) g/L，差異在統(tǒng)計學上有顯著性(P<0.05). 上述結(jié)果表明, 與正常對照組相比,惡性腫瘤患者循環(huán)DNA水平明顯升高, 循環(huán)DNA的含量檢測對腫瘤的診斷有一定的價值,其可能是腫瘤診斷的一個重要生物學指標.本研究我們構(gòu)建了ROC曲線來評價循環(huán)DNA定量的敏感度及特異度,以此確定診斷乳腺癌的截斷(cutof)值. 結(jié)果發(fā)現(xiàn): 分別采用19 g/L和22 g/L作為正常人群組和具有高危性的乳腺良性病變患者組診斷乳腺癌的臨界值時, 敏感度及特異度各不相同. 因此， 循環(huán)DNA檢測適合作為臨床診斷乳腺癌指標，但在不同受試人群

11、中需根據(jù)檢查目的使用不同的截斷(cutoff)值.以循環(huán)DNA為基礎(chǔ)的核酸分析對于探測腫瘤特異的細胞外DNA, 是一種新的、有潛在價值的癌癥檢測和監(jiān)測方法. 當然,迄今仍沒有足夠的證據(jù)顯示10,細胞外核酸能代替細胞內(nèi). 但循環(huán)中的癌基因或相關(guān)DNA的檢測對于癌癥的篩選、診斷和監(jiān)測有重要的意義, 血漿腫瘤循環(huán)DNA有可能成為一種新的惡性腫瘤標志物.【參考文獻】1 Chiu RW, Chan LY, Lam NY, et al. Quantitative analysis of circulating mitochondrial DNA in plasma J. Clin Chem, 2003,

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