時間分辨熒光免疫分析法產(chǎn)前篩查原理與操作規(guī)程

1、時間分辨熒光免疫分析法產(chǎn)前篩查原理與操作規(guī)程一、產(chǎn)前篩查定義及其原理產(chǎn)前篩查（Prenatal Screening)是指通過經(jīng)濟(jì)、簡便和較少創(chuàng)傷的檢測方法，從孕婦群體中發(fā)現(xiàn)懷有某些先天缺陷胎兒的高危孕婦，以便進(jìn)而進(jìn)行診斷，以最大限度地減少異常兒的出生。血清學(xué)標(biāo)志物產(chǎn)前篩查已成為非侵入性產(chǎn)前診斷的重要方法。目前產(chǎn)前篩查的兩種主要疾病是唐氏綜合征（Downs Sydrome，DS；又稱21三體綜合征）和胎兒神經(jīng)管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三體綜合征。產(chǎn)前篩查可以在妊娠早期（713周）或中期（1421周）進(jìn)行。目前用于產(chǎn)前篩查的血清學(xué)標(biāo)志物有：甲胎蛋白

2、（AFP）、游離-絨毛膜促性腺激素（F-hCG）、游離雌三醇（uE3）、妊娠相關(guān)血漿蛋白（PAPP-A）、抑制素A（inhibin A）等。產(chǎn)前篩查實(shí)驗(yàn)測量通用評價(jià)指標(biāo)為中位值倍數(shù)（MOM），正常妊娠特定的MOM=標(biāo)本檢測濃度/相應(yīng)孕周中位值濃度。產(chǎn)前篩查系統(tǒng)由體外診斷試劑、檢測儀器和篩查分析軟件組成。檢測儀器配合體外診斷試劑檢測出孕婦血清中標(biāo)記物（AFP、F-hCG、PAPP-A等）的濃度，將檢測數(shù)據(jù)及孕婦相關(guān)因素輸入篩查分析軟件中，即可得出唐氏綜合征（DS）和神經(jīng)管缺陷（NTD）篩查的結(jié)果。由于目前的技術(shù)水平的限制，產(chǎn)前篩查技術(shù)都不能做到篩查100%正確。假陰性病例因此會誤診，假陽性病例一

3、般在產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)時被糾正。二、唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查唐氏綜合征是人類最常見的一種染色體病，發(fā)病率約1/8001/600，男性多于女性。1866年英國醫(yī)生Langdom Down 首次對此病進(jìn)行臨床描述，因此命名稱為Down，s Syndrome，簡稱DS。1959年Lejeune首先發(fā)現(xiàn)本病的病因是多了一條21號染色體，故又將其命名為21三體綜合征。唐氏綜合征的主要臨床表現(xiàn)：嚴(yán)重智力低下、愚型面容，約50%伴有先天性心臟病、小頭畸形等發(fā)育異常。目前對DS尚未有治療方法，因此通過產(chǎn)前篩查找出高危孕婦，對其進(jìn)行產(chǎn)前診斷是防止患兒出生的重要手段。1.以孕婦年齡作為篩查指標(biāo)最早用于DS的篩查指標(biāo)為孕婦年

4、齡。早期研究發(fā)現(xiàn)，DS的發(fā)病率隨孕婦年齡增高而增高，1977年Hook和Chambers報(bào)道了孕婦年齡在2030歲之間，發(fā)病率呈線性增加，而在33歲左右呈對數(shù)增加，孕婦年齡為35歲時，發(fā)病率約1/384，40歲時約1/110，比30歲時增加了8倍，如圖1。一般認(rèn)為35歲以上的孕婦是DS的高危人群，是要進(jìn)行羊膜腔穿刺的指征。但深入研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，若僅以孕婦年齡35歲作為篩查指標(biāo)，DS的檢出率約20%，而約80%的胎兒DS是在年齡小于35歲的孕婦人群中。因此，不少國家的篩查機(jī)構(gòu)指出“DS 產(chǎn)前篩查應(yīng)面向所有孕婦而不考慮年齡”。僅用孕婦年齡指標(biāo)不夠全面，應(yīng)結(jié)合應(yīng)用孕婦血清標(biāo)志物指標(biāo)或超聲波形態(tài)學(xué)聯(lián)合篩

5、查診斷。圖1 孕婦年齡與胎兒發(fā)生唐氏綜合征風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系2. 以孕婦血清標(biāo)志物為篩查指標(biāo)1984年英國Merkatz等最先發(fā)現(xiàn)懷有DS胎兒的孕婦血清AFP含量降低，這在產(chǎn)前篩查史上是一個劃時代的進(jìn)步，建議將AFP作為35歲以下孕婦胎兒DS的篩查指標(biāo)。這一發(fā)現(xiàn)很快被其它實(shí)驗(yàn)室證實(shí)，1987年Bargot發(fā)現(xiàn)懷有DS胎兒的孕婦血清中的hCG的水平是正常孕婦的2倍，以孕婦年齡再結(jié)合血清中hCG檢測，DS的篩查率可達(dá)到63%。1988年，Canick等發(fā)現(xiàn)懷有DS胎兒的孕婦血清中uE3的水平比正常孕婦低25%。同年，倫敦Bartholomews醫(yī)院Wald提出AFP、ß-hCG、uE3三聯(lián)的篩查

6、方法。1994年美國婦產(chǎn)科學(xué)院向全美醫(yī)學(xué)界正式推薦這一組合，并得到廣泛應(yīng)用，一直至今。在上世紀(jì)90年代，有學(xué)者還相繼發(fā)現(xiàn)PAPP-A、inhibin A、糖原抗原125（CA-125）等與孕婦懷DS胎兒有關(guān)。也將逐步應(yīng)用到DS的產(chǎn)前篩查中。甲胎蛋白（AFP） 是胎兒血清中最常見的蛋白質(zhì)，1956年由Bergstrandh和Czar在人胎兒血清中發(fā)現(xiàn)的一種甲種球蛋白。早孕期由卵黃囊產(chǎn)生，晚孕期由胎兒肝臟大量產(chǎn)生。胎兒血中的AFP經(jīng)排尿進(jìn)入羊水并通過胎盤屏障滲入母血。孕10周即可在母血中測出AFP，孕1120周AFP濃度呈線性升高，3234周（有文獻(xiàn)為2832周）達(dá)到高峰，以后逐漸下降，分娩后幾天

7、降為0。且孕早期以AFP單項(xiàng)篩查胎兒染色體異常無意義，因此母血中AFP的檢測在孕中期1420周進(jìn)行。正常孕婦血中AFP含量變化見圖2與表1。當(dāng)孕婦胎兒患DS時，由于胎兒生長發(fā)育遲緩，組織器官發(fā)育不全，肝臟、胎盤的功能不良，合成AFP能力降低，致使孕中期母血清AFP水平下降（一般<0.5MOM，有的以<0.4MOM或<0.7MOM為標(biāo)準(zhǔn)）。但當(dāng)胎兒出現(xiàn)開放性神經(jīng)管缺損或腹壁缺損時，破壞了阻止AFP外溢的胎兒屏障，使胎兒體內(nèi)高濃度的AFP釋放，滲透入母體循環(huán)，引起母體血清中的AFP顯著升高。因此，AFP也可作為神經(jīng)管畸形的篩查指標(biāo)。參考：馬云寶，顧軍，何雪云.醫(yī)學(xué)特種檢測的臨床應(yīng)

8、用，第1版.北京：原子能出版社，1-2.圖2 正常妊娠母血中AFP含量變化趨勢表1 正常妊娠母血清AFP含量參考值（ug/L）孕周中位數(shù)0.4MoM0.7MoM2.0MoM2.5MoM14-1541.2616.5028.8882.50103.1516-1754.1521.6637.91108.30135.3818-1969.2727.7148.49138.54173.1820-2191.5836.6364.11183.16228.9522-23127.6251.0589.33255.24319.0524-25155.1162.04108.53310.22387.7826-27190.3976.

9、16133.27380.78475.9828-29252.80101.13176.96505.60632.0030-31250.72100.29175.50501.44626.8032-33321.07128.43224.75642.14802.6834-35203.1681.26142.21406.31507.8936-37184.9273.97129.44369.84462.3038-39226.6890.67158.67453.35566.6940-42140.4156.1698.29280.82351.03摘自：方群.婦產(chǎn)科檢驗(yàn)診斷學(xué)，第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，62.絨毛膜促性腺激

10、素（hCG） 是胎盤的合體滋養(yǎng)層分泌的一種糖蛋白，為胎盤中最重要的激素，由和亞基組成，兩個亞基可彼此結(jié)合，也可游離于血液中。孕婦血清中的hCG主要以完整的形式存在，游離形式的-hCG（F-hCG）占總hCG的18%。妊娠期母血清中-hCG水平呈雙峰曲線，第1峰于妊娠12周前后（一般810周或912周），15周后出現(xiàn)生理性下降，2032周維持低而平穩(wěn)水平，26周達(dá)最低。第2峰于妊娠37周，明顯低于第1峰，至妊娠足月時稍有下降。在妊娠11周內(nèi)，血清-hCG的含量與孕齡密切相關(guān)，隨妊娠進(jìn)展呈直線上升，孕齡每增加1天，-hCG平均增加1.53IU/ml（hCG約每1.3天上升2倍，如未達(dá)到此水平，此次

11、妊娠可能是輸卵管妊娠宮外孕，應(yīng)動態(tài)觀察），分娩后急劇下降，產(chǎn)后4天降至1 IU/ml，產(chǎn)后9天基本消失。正常妊娠母血清hCG含量見表2與表3。胎兒患DS時，胎盤重量低于正常水平，組織器官發(fā)育不全，肝臟、胎盤的功能不良，因此孕婦血清中hCG濃度下降要比懷正常胎兒的孕婦晚3周左右，致使孕中期（約20周左右）母血清中的hCG濃度呈高水平狀態(tài)，懷DS兒孕婦血清中游離的-hCG濃度比正常孕婦至少高2倍（一般>2.5MOM），如圖3。表2 正常妊娠母血清hCG含量參考值（U/L） 妊娠期（周） 受精后 距末次月經(jīng) U/L2 4 51003 5 20030004 6 1000080000512 714

12、 900005000001324 1526 5000800002638 2740 300015000摘自：周新，涂植光.臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)，第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，435.表3 正常妊娠母血清-hCG含量參考值（mIU/ml）孕周1-hCG孕周2-hCG孕周2-hC7±3304.92018568.7±3718.22421001456146±24314.92118046.1±6691.531065001548704.5±33045.52220174.2±15022.346310001638275.

13、4±21572.42322282.3±5493.35150100001729620.6±11921.42416393.1±4735.371000150001828100.5±11952.82519403.9±7825.39121200200001929392.4±13482.82617455±9505.5摘自：1.韋振元等.血清-hCG、HPL和-hCG/HPL比值對婦產(chǎn)科疾病的臨床意義.標(biāo)記免疫分析與臨床，1999，6（1）：9-12.2. 王曉雯等.孕中期各周-hCG正常值測定及其臨床意義.中國優(yōu)生與遺傳雜志，

14、2000，8（2）：62.圖3 ß-hCG在正常孕婦和懷有唐氏胎兒孕婦血清中的分布游離雌三醇（uE3） 是雌二醇（E2）和雌酮（E1）的代謝產(chǎn)物，在非妊娠女性中濃度很低，而在妊娠后期濃度則明顯增加。只有約9%的E3在血液循環(huán)中游離為uE3。在妊娠后期E3由胎兒腎上腺、胎肝和胎盤大量合成，反映了胎兒和胎盤雙方面的功能。母體血清E3約90%來自此合成途徑，少量由母體卵巢前體生成。E3生物合成途徑的中斷將導(dǎo)致母體血清E3低水平。造成E3途徑中斷的情況：胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、無腦畸形、胎盤硫酸酯酶缺乏、死胎、染色體異常等，缺乏E3的孕婦分娩期將推遲。在胎兒正常發(fā)育的情況下，其母體內(nèi)uE3含量自2

15、934周逐漸上升，3536周開始快速上升，在4142周（3738周或4041周）達(dá)高峰，正常妊娠孕婦uE3參考值見表4與圖4。uE3被用于胎兒DS篩查主要在孕中期，應(yīng)注意正常妊娠孕婦uE3是孕中期變化最大的指標(biāo)，必須核對孕周。在孕婦懷DS胎兒時，母體血清中uE3表現(xiàn)為降低異常（一般<0.7MOM）。目前uE3已是多標(biāo)記聯(lián)合篩查中用得相當(dāng)普遍的標(biāo)記物之一。表4 正常妊娠孕婦血清uE3參考值(±s,g/L)孕周例數(shù)FE3孕周例數(shù)FE31762.2±0.6302011.2±2.718443.7±1.1312312.3±2.719344.8

16、77;1.4322614.6±3.520305.6±1.5331621396.6±1.8341122396.6±1.835923418.0±2.136915.2±3.924338.3±2.2371215.0±4.225268.8±2.0381117.0±3.726418.8±2.6391324.7±7.127298.8±2.5401925.9±8.628258.9±2.4411036.9±7.029279.6±2.4引自：徐增

17、秀,徐燕紅,彭曉燕,等.正常孕婦血清游離雌三醇動態(tài)監(jiān)測的臨床價(jià)值.標(biāo)記免疫分析與臨床,2000,7(2): 74-75.05101520253017202326293639孕周uE3濃度g/L圖4 正常妊娠孕婦血清uE3含量變化趨勢妊娠相關(guān)血漿蛋白（PAPP-A） 是一種大分子糖蛋白，PAPP-A由胎盤合體滋養(yǎng)層和蛻膜產(chǎn)生，屬于2巨球蛋白，具有激活補(bǔ)體，起免疫抑制的作用（其生物功能目前尚未完全清楚）。早在1974年Lin等首次報(bào)道了孕早期母血中PAPP-A的研究，指出PAPP-A起源于絨毛周圍纖維蛋白，其水平隨孕周增加而增加。后來諸多學(xué)者分別在孕早期應(yīng)用PAPP-A結(jié)合F-hCG（或hCG）作

18、為DS篩查指標(biāo)，證實(shí)PAPP-A是一種最有意義的標(biāo)志物。Wald等及Haddow等在綜合歸納了9個國家21個產(chǎn)前篩查診斷中心的研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，用孕婦7種血清標(biāo)志物以不同組合作篩查指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，PAPP-A診斷DS效果較滿意，特別是結(jié)合F-hCG組合時陽性檢出率可達(dá)60%，其中假陽性率僅為5%。Zimmermann等檢測了1151例21三體和18三體患者的PAPP-A水平，中位數(shù)的倍數(shù)分別是0.51和0.08 ，結(jié)果顯示PAPP-A可作為妊娠DS胎兒產(chǎn)前篩查一個獨(dú)立的標(biāo)志物。 孕早期就可以在母體血清中檢測到PAPP-A（單胎受精后32天，雙胎受精后21天即可在孕婦血清中檢測到），隨著

19、妊娠進(jìn)展，母體PAPP-A水平升高，到妊娠足月時達(dá)到高峰，此時母血PAPP-A濃度是羊水的10倍，產(chǎn)后6周即測不到。而整個妊娠期間，胎血中測不道PAPP-A，這是因?yàn)镻APP-A分子量大，不能透過胎盤進(jìn)入血循環(huán)。PAPP-A具有以下優(yōu)點(diǎn)：在孕早期階段，母血中即可測到。當(dāng)其他妊娠蛋白水平開始下降時，母血PAPP-A水平仍在升高，它是唯一的一種在母血中濃度最高，羊水中次之，胎血中不含有的妊娠蛋白。由于DS胎兒的器官包括胎盤均發(fā)育不全，胎盤合體滋養(yǎng)層功能下降，合成PAPP-A減少，因此懷有DS胎兒的孕婦，其血清中PAPP-A一般低于0.25MOM0.51MOM。在孕早期低水平的PAPP-A是篩查染色

20、體異常胎兒的很好指標(biāo)，尤其是DS胎兒，陽性檢出率可達(dá)66。此外，有自然流產(chǎn)、異位妊娠、胎兒生長遲緩、胎死宮內(nèi)時，孕婦血清PAPP-A亦呈低值，這與胎盤功能不全，使其合成減少有關(guān)。正常妊娠孕婦血清PAPP-A參考值見表5與圖5。該指標(biāo)在孕早期較為敏感，檢測PAPP-A前最好以B超檢查確定孕齡，孕14周后21三體妊娠與正常妊娠無明顯差別，PAPP-A的最佳篩查時間為妊娠1014周，<0.5MOM應(yīng)作產(chǎn)前診斷。PAPP-A<0.5MOM也可見于胸腹腔積液、雙腎積水、腹水、羊水過多、死胎等；PAPP-A>2.5MOM可見于唇裂、尿道下裂等。表5 正常妊娠孕婦血清PAPP-A參考值（m

21、IU/ml）孕周平均數(shù)中位數(shù)0.5倍中位數(shù)2.5倍中位數(shù)40.0080.0120.0060.03050.0740.0340.0170.08580.7840.3210.1600.805114.9463.2691.6348.1731411.37410.8805.44027.2001716.25315.7837.89239.4582022.39221.92010.96054.8002326.07625.82012.91064.5502624.67426.63513.31866.5882930.36127.21013.60568.0253228.88829.54014.77073.8503535.10

22、831.31015.65578.2753834.23337.36018.68093.4004131.76534.46017.23086.150引自：章曉梅，李春華，馮懷英，等.孕婦血清PAPP-A蛋白測定早期篩查染色體病.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2001，9（2）：24-38.0.00020.00040.00060.00080.000100.0004581114172023262932353841孕周系列1系列2系列3系列4注：4-41周孕婦血清PAPP-A濃度曲線，系列1為濃度平均數(shù)，系列2為中位數(shù)，系列3為0.5倍中位數(shù)，系列4為2.5倍中位數(shù)。圖5 正常妊娠孕婦血清PAPP-A含量變化趨勢抑

23、制素A（inhibin A） 被認(rèn)為是一個由合胞體滋養(yǎng)層產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，1992年有學(xué)者開始研究其與DS胎兒的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)孕婦血清中與DS胎兒相關(guān)的主要物質(zhì)是二聚體抑制素A。Aitken等研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠78周檢測二聚體抑制素A，懷DS胎兒的孕婦血清中二聚體抑制素A濃度較正常孕婦的高出2倍。進(jìn)一步結(jié)合AFP、hCG能大大提高DS的檢出率，在一些多標(biāo)記聯(lián)合篩查中發(fā)現(xiàn)其作用不可忽視，甚至超過uE3的趨勢。糖原抗原125（CA-125） 為一種大分子量糖蛋白，其生理功能目前尚有爭議。1990年Cherk等報(bào)道孕早期孕婦血清中糖原抗原125水平高于正常值，可能與胎兒自發(fā)流產(chǎn)和DS有關(guān)。1997年W

24、enstrom等用研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，這一標(biāo)記在篩查DS胎兒時，其陽性率可達(dá)45%，并認(rèn)為這一標(biāo)記可用于多標(biāo)記聯(lián)合篩查。三、胎兒神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查胎兒神經(jīng)管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs）是出生缺陷最常見疾病類型之一，其發(fā)病是由于受精后2024天內(nèi)神經(jīng)盤折疊過程中神經(jīng)管不能閉合導(dǎo)致的。多數(shù)的神經(jīng)管缺陷是開放性的，神經(jīng)組織完全暴露或僅僅蓋有一層薄薄的透明膜；只有極少部分損傷是閉合性的，神經(jīng)組織由皮膚或一層很厚的膜完全覆蓋。無腦畸形、脊柱裂、腦膨出是神經(jīng)管缺陷三種主要類型。1977年首次報(bào)道血清中AFP水平升高和開放性神經(jīng)管缺陷畸形有關(guān)，因?yàn)殚_放性損傷時胎兒體內(nèi)高濃度的AF

25、P有可能通過胎兒血液循環(huán)到達(dá)羊水，再通過羊膜滲入母體循環(huán)，引起母體血清中的AFP顯著升高。因此通過檢測孕婦血清中AFP濃度可以進(jìn)行神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查，可以檢出8090%的開放性神經(jīng)管缺陷。在英國，由于開展了神經(jīng)管缺陷胎兒血清篩查，其神經(jīng)管缺陷胎兒的出生率從1960年的1/350降至1987年的1/2500,下降了86。結(jié)果說明AFP是一個很有效的神經(jīng)管缺陷篩查指標(biāo)（一般>2.5MOM，它在篩查胎兒神經(jīng)管缺陷中的作用是其它標(biāo)志物無法替代的）。四、18-三體綜合征的產(chǎn)前篩查18三體綜合征可以用孕婦血清聯(lián)合篩查，懷有18三體綜合征胎兒的孕婦孕中期血清hCG、AFP和uE3水平降低，以AFP0

26、.75MOM；hCG0.55MOM；uE30.60MOM為切割值，18三體綜合征胎兒陽性檢出率可達(dá)出6080%。五、產(chǎn)前篩查血清標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)前篩查各種不同血清標(biāo)志物篩查特性見表6。表6 各種不同血清標(biāo)志物篩查特性血清標(biāo)志物來源適用孕周陽性表現(xiàn)陽性檢出率篩查胎兒缺陷使用評價(jià)AFP胎肝152121三體，NTDs30%各種三體綜合征，NTDs作用肯定，普遍應(yīng)用-hCG胎盤82121三體51%各種三體綜合征作用肯定，普遍應(yīng)用uE3胎兒腎上腺，肝臟，胎盤142121三體30%各種三體綜合征作用有爭議，應(yīng)用較普遍PAPP-A胎盤合體滋養(yǎng)層81421三體54%各種三體綜合征作用肯定，普遍應(yīng)用INHA胎

27、盤合體滋養(yǎng)層，黃體142121三體41%各種三體綜合征作用有爭議，應(yīng)用漸增多21三體綜合征：妊娠中期母血AFP下降，uE3下降，F(xiàn)-hCG上升（三聯(lián)篩查方法）。PAPP-A和F-hCG在妊娠10周左右有較大價(jià)值，PAPP-A下降，F(xiàn)-hCG上升，檢出率達(dá)63%，這個組合已成為孕早期篩查最佳組合。有學(xué)者認(rèn)為四聯(lián)篩查方法（AFP，uE3，F(xiàn)-hCG，INHA）的檢出率優(yōu)于三聯(lián)篩查方法。神經(jīng)管缺陷：孕早期母血AFP和F-hCG正常，PAPP-A下降；孕中、晚期PAPP-A明顯下降，AFP上升。18三體綜合征（Edward綜合征）：PAPP-A和F-hCG具有孕早期篩查18三體綜合征的價(jià)值，母血F-h

28、CG和PAPP-A下降；孕中期，18三體綜合征母血AFP下降，uE3下降，F(xiàn)-hCG下降。13三體綜合征（Patau綜合征）：血清標(biāo)志物變化與是否合并神經(jīng)管缺陷有關(guān)。Turner綜合征：妊娠中期uE3下降，AFP改變不明顯或增高。如有胎兒非免疫性水腫hCG上升，否則hCG下降。染色體三倍體：當(dāng)為69條染色體時，血清標(biāo)志物變化各不相同，一般認(rèn)為AFP上升，uE3下降，F(xiàn)-hCG或高或低。死胎：孕早期和孕中、晚期死胎，母血F-hCG和PAPP-A均明顯下降（胎盤功能破壞），而AFP升高（胎肝合成的AFP溢漏）。多胎：AFP、uE3、F-hCG均升高。六、產(chǎn)前血清標(biāo)志物篩查的影響因素影響血清標(biāo)志物的

29、因素較多，易造成假陽性或假陰性，需采取措施予以糾正。1孕周估計(jì)誤差：妊娠周齡對篩查結(jié)果計(jì)算十分重要，計(jì)算方法有兩種：由末次月經(jīng)（LMP）日期來推算，這種方法對月經(jīng)周期規(guī)律者較好，但對月經(jīng)周期不規(guī)則者不適用。超聲波測量胎兒的雙頂骨間徑(BPD)是較正確的方法。當(dāng)兩種方法計(jì)算懷孕天數(shù)誤差超過10天時，則以BPD為準(zhǔn)；不足十天的兩法均可。2. 多胎的影響：雙胎或多胎妊娠時，血清生化指標(biāo)明顯高于單胎妊娠。雙胎的DS檢出率要低于單胎。3. 孕婦體重：孕婦體重過重由于稀釋作用可使AFP、uE3、hCG水平降低。4. 母親自身疾?。涸袐D患有一些其他疾病時，可影響生化指標(biāo)。如孕婦為胰島素依賴性糖尿病時，母血清

30、AFP比正常同孕周孕婦低20%，而uE3和hCG水平升高。5. 母親吸煙：孕婦吸煙使AFP升高3%，hCG降低3%，uE3降低23%。6. 種族差異：不同種族的人群正常值不同，AFP在亞洲及黑人的水平較西班牙人和白種人高，hCG在非裔美國人中較高。因此，不同種族人群應(yīng)建立自己的正常值7. IVF與自然妊娠相比，hCG明顯升高而AFP明顯降低。七、產(chǎn)前篩查流程產(chǎn)前篩查流程：（遺傳咨詢），收集資料，采集血樣，檢測，風(fēng)險(xiǎn)評估，報(bào)告結(jié)果，病例追蹤，遺傳咨詢，存檔。如圖6、圖7與圖8。圖6 產(chǎn)前篩查流程圖圖7唐氏綜合征（DS）產(chǎn)前篩查流程圖圖8 神經(jīng)管缺陷（NTD）產(chǎn)前篩查流程圖八、產(chǎn)前篩查時間分辨熒光

31、免疫分析法實(shí)驗(yàn)操作常規(guī)1. 時間分辨熒光免疫分析法試劑盒檢測原理：目前已應(yīng)用的有標(biāo)記抗原與未標(biāo)記抗原（待測或標(biāo)準(zhǔn)品）競爭結(jié)合抗體的競爭法、固相抗原與游離抗原（待測或標(biāo)準(zhǔn)品）競爭結(jié)合標(biāo)記抗體的競爭法和固相雙位點(diǎn)夾心法等。應(yīng)用較多的為固相雙位點(diǎn)夾心法，如夾心一步法和夾心兩步法。方法簡便，可以得到滿意的靈敏度和特異性，批間批內(nèi)變異系數(shù)小，精密度高。TR-FIA夾心兩步法的檢測示意圖如圖9。圖9 TR-FIA夾心兩步法的檢測示意圖2. 時間分辨熒光免疫分析法實(shí)驗(yàn)室檢測流程：如圖10。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制Ø 采用TRFIA試劑二聯(lián)法AFP+HCG（F-HCG）報(bào)告唐氏綜合征風(fēng)險(xiǎn)率及神經(jīng)管缺陷的風(fēng)險(xiǎn)率

32、。篩查項(xiàng)目及實(shí)驗(yàn)步驟簡介（詳見說明書）Ø 目的: 保證每個孕婦樣本的測定結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性Ø 手段:1. 室間質(zhì)評系統(tǒng)誤差準(zhǔn)確度2. 室內(nèi)質(zhì)控隨機(jī)誤差精密度室內(nèi)質(zhì)控是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的基礎(chǔ),提高常規(guī)測定工作的批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性。實(shí)驗(yàn)室檢測Ø 系統(tǒng)誤差原因分析 1、樣本采集及方法或試劑分配器（加樣槍）不正確的調(diào)整；2、實(shí)驗(yàn)區(qū)域不恰當(dāng)溫度/濕度水平；3、試劑或校準(zhǔn)物批號改變；4、使用、保存或運(yùn)輸過程中試劑變質(zhì)；5、使用、保存或運(yùn)輸過程中校準(zhǔn)物變質(zhì)；6、使用、保存或運(yùn)輸過程中質(zhì)控物變質(zhì)；7、控制物非正確處理（冰凍）；8、在無霜冰箱中控制無不恰當(dāng)?shù)谋４妫?、在

33、實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中使用非試劑級別的水；10、儀器濾光片輪臟或光源減弱；11、儀器設(shè)備近來校準(zhǔn)；12、實(shí)驗(yàn)操作人員變換。Ø “室內(nèi)”質(zhì)控失控情況處理及原因分析 1、填寫失控報(bào)告單上報(bào)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人。2、由負(fù)責(zé)人作出是否發(fā)報(bào)告的決定。3、分析失控原因重做同一質(zhì)控物（人為差錯、偶然誤差） 新開一瓶質(zhì)控物（質(zhì)控物使用、保管） 重新校準(zhǔn)（校準(zhǔn)錯誤） 進(jìn)行儀器維護(hù)，更換試劑（儀器、試劑） 請專家?guī)椭?、完成失控報(bào)告單Ø 主要實(shí)驗(yàn)步驟試劑盒復(fù)溫標(biāo)記物的稀釋加樣加入標(biāo)記物工作液振蕩孵育洗滌反應(yīng)板加入增強(qiáng)液儀器檢測圖10 時間分辨熒光免疫分析法實(shí)驗(yàn)室檢測流程 3. 儀器操作流程與注意事項(xiàng)儀器操作流程：

34、開機(jī)軟件注冊軟件登錄軟件使用（進(jìn)入測試模塊選擇實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目新建測試板孔測試擬合分析）退出軟件關(guān)機(jī)填寫儀器操作記錄，具體操作如下：1. 打開半自動時間分辨熒光免疫分析儀(后下方綠色按鍵)儀器后面電源開關(guān)，再按下泰萊-I前面的白色按鍵啟動計(jì)算機(jī)。2. 打開半自動時間分辨熒光免疫分析儀右邊的測試電源開關(guān)(綠色按鍵) 3. 打開電腦桌面TALENT-I圖標(biāo)，進(jìn)入軟件登錄界面.4. 在登錄界面中輸入登錄編號“1”，再輸入登錄密碼“1”. 5. 在進(jìn)入半自動時間分辨熒光免疫分析儀軟件主界面后，按如下指示操作：屏幕顯示具體操作界面右邊顯示“測試，報(bào)告，質(zhì)控，歷史，設(shè)置”點(diǎn)擊“測試”，進(jìn)入下一界面界面左上方顯示編

35、號，項(xiàng)目類型，項(xiàng)目名稱如：1.類型：甲狀腺類 2.名稱：T3 選擇項(xiàng)目類型和項(xiàng)目名稱后，進(jìn)入右邊新建測試界面，并選擇最后一塊板的結(jié)束孔位，點(diǎn)“確定”，系統(tǒng)自動產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)批號和實(shí)驗(yàn)板號，點(diǎn)“板孔測試”界面右邊顯示您所要測試的藍(lán)色背景試管擺放圖點(diǎn)界面右下角的“測試”，儀器開始測試，測試完后點(diǎn)“板孔設(shè)定”顯示“設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)品”，“設(shè)定為質(zhì)控”，“設(shè)定為樣品”.填入試管擺放起始位.如第幾排第幾管.若做曲線，需點(diǎn)擊“設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)品”，并選好“復(fù)管數(shù)”；若做質(zhì)控，則點(diǎn)擊“設(shè)定為質(zhì)控”并選好高，中，低三種類型.在“設(shè)定為樣品”一欄中，選好樣品的起始位置，輸入樣品數(shù)，用1到N表示.每完成一項(xiàng)請點(diǎn)擊“確定”.完成上述

36、步驟后,點(diǎn)擊“擬合分析”,界面右邊顯示有“擬合,曲線,結(jié)果,打印,保存”,中下邊有“使用自測標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行擬合或校準(zhǔn)”在“使用自測標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行擬合或校準(zhǔn)”前打“”,即可得到測試分析后的曲線,點(diǎn)擊“擬合”,得到測試濃度,要看曲線分析情況,點(diǎn)擊“曲線”,擬合得到結(jié)果后點(diǎn)擊“打印”即可以打印測試結(jié)果.6. 上述操作全部完成后,點(diǎn)擊有整個界面右下角的“退出”,即可退出TALENT-I軟件.7. 關(guān)閉TALENT-I檢測儀電腦主機(jī)部分及顯示器的電源開關(guān),然后關(guān)閉測試電源開關(guān),最后關(guān)閉TALENT-I儀器的總電源開關(guān).8. 填寫相關(guān)記錄。注意事項(xiàng)：按照上面規(guī)定的開機(jī)和關(guān)機(jī)順序進(jìn)行開關(guān)機(jī)，以免損壞設(shè)備；進(jìn)行具體的

37、測量前，保證檢測儀部分開機(jī)預(yù)熱30分鐘以上；出現(xiàn)故障時可以參考“故障排除”一節(jié)的內(nèi)容進(jìn)行排除；出現(xiàn)不能解決的問題時，請及時與我公司售后服務(wù)部聯(lián)系。4. 實(shí)驗(yàn)操作與注意事項(xiàng)：以AFP和F-hCG為例，見下表7。1）.資料收集常規(guī)資料收集是最關(guān)鍵基礎(chǔ)的一步，直接影響檢測結(jié)果的分析。完整的資料包括：孕婦姓名、出生日期、聯(lián)系地址電話、孕周、體重、末次月經(jīng)日期、月經(jīng)是否規(guī)則、是否吸煙、胰島素依賴型糖尿病、曾出生先天愚型、雙胞胎。還有采樣日期，因?yàn)榻^大部分是采用末次月經(jīng)來推斷孕周的。影響因素與建議：對于月經(jīng)不規(guī)則的孕婦，為了得到準(zhǔn)確的孕周信息，要求其做B超確定孕周。必須要有孕婦的簽名，規(guī)避潛在的危險(xiǎn)。個體

38、差異可能導(dǎo)致漏檢。2）. 血樣采集常規(guī)采集時間：孕早期：7-13周；孕中期：14-21周。采集的量：3-5毫升靜脈血即可。標(biāo)本保存：分離血清，4可保存5天左右；條件允許-20冷凍保存。影響因素與建議：（1）標(biāo)本中的hCG隨時間延長和溫度增高會分解為亞基和亞基。由于游離的亞基在血清中含量非常低，分解出來的亞基會在很大程度上影響亞基的檢測水平，而對完整的hCG的影響則相對較小。因此用亞基作為指標(biāo)有可能增加假陽性率。為此實(shí)驗(yàn)室在運(yùn)輸或保存標(biāo)本時要近量避免溫度的升高。有學(xué)者研究表明，30 6h或35 2h即可使項(xiàng)目濃度明顯提高，血標(biāo)本應(yīng)及時分離（采用3000rpm 6min以上或2000rpm 15m

39、in），分析時室溫較高且標(biāo)本較多，建議將標(biāo)本置于泠水浴中。（2）本試劑采用的是一步法，不能采用血漿標(biāo)本，EDTA、檸檬酸鹽等螯合劑會影響銪標(biāo)記的穩(wěn)定性，使熒光值偏低。（3）標(biāo)本避免反復(fù)凍融，會使檢測物質(zhì)活性（效價(jià)）降低。對溶血、黃疸、脂血等標(biāo)本應(yīng)在報(bào)告單上注明，特別含大量脂質(zhì)、嚴(yán)重黃疸及溶血或加熱滅活之標(biāo)本均可能影響檢測結(jié)果，可建議重新采血。已稀釋的血清不宜存放，稀釋樣本應(yīng)先加稀釋液，再加樣本，避免非特異性吸附。 3）. 試劑準(zhǔn)備（1）微孔反應(yīng)板：將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫（2025）。余下的微孔板條及時置入自封袋密閉并于28保存。（2）洗滌液：將40ml濃縮洗液和960ml蒸餾

40、水在干凈的容器中混合，作為工作洗滌液備用。蒸餾水敬請用戶自備。（3）標(biāo)記物工作液：使用前配制，將hAFP或F-hCG標(biāo)記物與實(shí)驗(yàn)緩沖液按體積比1：100加進(jìn)潔凈的一次性容器中并混勻，當(dāng)次試驗(yàn)用完。影響因素與建議：（1）免疫反應(yīng)受溫度影響，在一定范圍內(nèi)隨溫度的提高，反應(yīng)加快。平衡溫度可保證實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的均一性。（2）配置試劑采用去離子水或蒸餾水，避免酸、乙醇、螯合劑、氧化消毒劑等物質(zhì)混入。（3）準(zhǔn)確配制洗液，洗液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原、抗體解吸附而影響實(shí)驗(yàn)測定下限。（4）標(biāo)記物工作液要在使用前配制，容器潔凈，充分混勻，避免水分揮發(fā)和污染（避免標(biāo)記物的揮發(fā)造成實(shí)驗(yàn)室污

41、染,導(dǎo)致本底過高）。4）. 加樣準(zhǔn)確吸取25µl的hAFP或F-hCG標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品（Std）、待測樣本(Unk)，依次加入微孔反應(yīng)板微孔中。影響因素與建議：（1）建議每次實(shí)驗(yàn)必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測樣本作復(fù)孔檢測。標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后28可以保存6天；如長期保存請?jiān)?0存放，并避免反復(fù)凍融。（2）試劑要混勻，不可劇烈顛倒。加樣槍要定時校準(zhǔn)，在萬分之一天平上誤差<10%。加樣槍按鈕壓至第一檔垂直握持，使吸嘴浸入液體，浸入深度:20ul和10ul1mm,100ul2-3mm，200ul和1000 ul2-4mm，5000ul3-6mm，10000ul5-7mm，避免槍頭外殘留過多，導(dǎo)致結(jié)果偏高

42、。加樣要準(zhǔn)確一致，不可產(chǎn)生氣泡、濺出，移液槍頭要一次性使用，避免交叉污染，干吸頭預(yù)先在血清中反復(fù)抽吸三次，保證吸樣量準(zhǔn)確，吸嘴要伸入反應(yīng)孔底部1/4-1/3處加樣，?？?s，避免樣本在反應(yīng)孔上部滯留，導(dǎo)致非特異性吸附。使用連續(xù)加樣槍，按常規(guī)速度和程序，重復(fù)吸加10次，計(jì)算誤差率50ulCV1.5%，100ulCV1.0%，1000ulCV0.8%。定期進(jìn)行定標(biāo)，超標(biāo)時予以更換。5）.加銪標(biāo)記物向每孔中加入200µl已配好的標(biāo)記物工作液，并加貼封片。影響因素與建議：一定要貼加封片，防止液體揮發(fā)和污染（避免標(biāo)記物的揮發(fā)造成實(shí)驗(yàn)室污染,導(dǎo)致本底過高）。對于同一批實(shí)驗(yàn)，使用同樣的標(biāo)記物，否則影響批內(nèi)重