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文檔簡介

1、測序常見問題分析實(shí)例 峰型整齊,在某一點(diǎn)前后突然變亂信號迅速衰減信號極弱或無信號整條序列信號雜亂                                       峰型整齊,在某一點(diǎn)前后突然變亂: 圖1 Pol

2、yT特殊結(jié)構(gòu)     上圖是我們的一個(gè)質(zhì)粒測序樣品,用T7通用引物進(jìn)行測序,從圖中可以看出,在約285bp的polyT結(jié)構(gòu)后,序列明顯變亂。主要原因是在polyT結(jié)構(gòu)后,測序酶容易在模板上滑動,導(dǎo)致polyT結(jié)構(gòu)后的峰型變得雜亂。此類樣品通過對其反向互補(bǔ)序列進(jìn)行測序,一般可以得到好的結(jié)果。圖2 移碼突變雙模板的存在    上圖是我們的一個(gè)質(zhì)粒測序樣品,用M13+通用引物進(jìn)行測序,從圖中可以看出,該序列在290bp后序列明顯有兩套峰存在。造成該現(xiàn)象的原因可能有如下幾條:序列發(fā)生缺失突變插入外援片段的載體和未插入外援片段的載體同時(shí)存在PC

3、R產(chǎn)物用T載體進(jìn)行克隆時(shí),PCR片段可以以兩個(gè)方向克隆進(jìn)T載體所挑克隆不純兩個(gè)大小相近的PCR產(chǎn)物同時(shí)存在,無法純化分開解決的辦法:對于質(zhì)粒模板,重新挑選克隆,或從另一段進(jìn)行測序?qū)τ赑CR模板,用另一端引物進(jìn)行測序,或克隆后進(jìn)行測序圖3 等位基因雙模板的存在    上圖是針對一個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行的測序結(jié)果,從圖中可以明顯看出,在序列的80bp到120bp之間有兩套峰存在,但是沒有發(fā)生移碼突變。該情況與圖2所舉的例子有所不同,該情況下從反向進(jìn)行測序仍然不可能得到好的測序結(jié)果。該種情況下只能采取克隆的方法將兩套模板分開,分別進(jìn)行測序。信號迅速衰減   &#

4、160;                                                 &#

5、160;                 返回 圖4 CTT重復(fù)結(jié)構(gòu)    如上圖,在大約260堿基后出現(xiàn)了一個(gè)嚴(yán)重的CTT重復(fù)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致信號迅速衰減,很難得到跨過該區(qū)后的信息。該種情況下,只能從另一端進(jìn)行測序,一般來說,AAG重復(fù)結(jié)構(gòu)不會太影響測序。也可以對片段進(jìn)行亞克隆,使每個(gè)片段大小不大于200bp,然后再進(jìn)行測序。不過,該方法要麻煩很多。 圖5 GGT重復(fù)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響測序  &#

6、160;  上圖下半部分是一個(gè)質(zhì)粒模板用M13+通用引物進(jìn)行測序,大約在130bp開始,出現(xiàn)GGT重復(fù)結(jié)構(gòu),測序信號迅速減弱至消失。上圖的上半部分是用M13-通用引物從反向進(jìn)行測序,在反向序列上該重復(fù)是GGT的反向互補(bǔ)序列,即ACC,大約在500bp處,測序很輕松地就讀過了ACC重復(fù)序列區(qū)。GGT重復(fù)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響測序的原因是在測序試劑盒中,為了得到均勻的測序峰型圖,G和T堿基均進(jìn)行了替代,分別替代成I和U,因此與模板的結(jié)合能力減弱,測序酶反應(yīng)到此后就比較難延伸下去,導(dǎo)致該區(qū)域后信號迅速減弱。通過優(yōu)化多種條件,可以對結(jié)果有一點(diǎn)改善,但仍然不能得到可用的結(jié)果。對該類型的模板,對反向互補(bǔ)鏈

7、進(jìn)行測序,可以很輕松地跨過該區(qū)域。  圖6 GC特殊結(jié)構(gòu)區(qū)    上圖是一個(gè)質(zhì)粒模板用M13+通用引物進(jìn)行測序的結(jié)果,序列中存在一個(gè)GC特殊結(jié)構(gòu)區(qū),在該區(qū)域后,信號迅速減弱。上圖的下半部分是對測序反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化后的測序結(jié)果,在GC特殊結(jié)構(gòu)后,測序信號得到一定程度的改善,但是離一般的測序結(jié)果還是相差甚遠(yuǎn)。針對該類型的模板,一般應(yīng)從反向進(jìn)行測序,然后在該特殊結(jié)構(gòu)區(qū)附近將兩個(gè)方向的測序結(jié)果拼接起來,得到完整的序列。圖7 模板特殊結(jié)構(gòu)    上圖是一個(gè)pGEM-T載體用M13+引物進(jìn)行測序,可以看出,序列在載體后迅速衰減,造成此現(xiàn)象的

8、原因一直不明,我們試用了多種方法試圖解決該測序問題,但幾乎毫無效果。該種情況很有可能是在全序列中有大的特殊結(jié)構(gòu),造成嚴(yán)重的二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu),使測序酶無法讀過此區(qū)域。正常情況下pGEM-T載體測序結(jié)果非常理想。                         返回信號極弱或無信號 造成該現(xiàn)象主要有兩個(gè)原因:模板質(zhì)量極差;   引物與模板序列不匹配。 圖8

9、 pGEM質(zhì)粒用T3通用引物進(jìn)行測序,測序結(jié)果無可用信息,因?yàn)閜GEM載體上無T3通用引物結(jié)合位點(diǎn)。上圖中兩處峰前面的一個(gè)主要是未去除的測序反應(yīng)單體造成的,靠右邊的一處峰主要是引物的非特異性反應(yīng)造成的。       在我們每天的測序樣品中,有相當(dāng)一部分測序失敗的樣品是由于缺少引物結(jié)合序列造成的,主要有下面幾種原因可能造成該種結(jié)果:客戶提供了錯(cuò)誤的載體信息或引物信息,用客戶自己在克隆片段上的引物對質(zhì)粒進(jìn)行測序,但是該質(zhì)粒為空載體,不包含插入片段。載體由于突變,丟失了原來的引物結(jié)合位點(diǎn)。圖9 一個(gè)PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果,整個(gè)序列信號極低,幾

10、乎無可用信息。造成該現(xiàn)象主要是在測序反應(yīng)中,模板的量太低,所得信號太弱。       重新提供足夠量的模板一般可以得到較好的測序結(jié)果。                          返回  整條序列信號雜亂       模板本

11、身的問題: 圖10 一個(gè)污染的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果,可以看出,整條序列都有極高的背景。 有以下幾個(gè)原因可能造成測序模板污染:   PCR產(chǎn)物有雜帶 質(zhì)粒類型的模板克隆不純 對于PCR類型的模板,我們現(xiàn)在都采取切膠的方法進(jìn)行純化。該純化方法一般情況下可以將PCR產(chǎn)物的雜帶及多余的引物去掉。但是,當(dāng)擴(kuò)增的片段中包含有大小非常近似的片段時(shí),切膠純化的方法也無濟(jì)于事了。該情況下只能采取將待測的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序了。質(zhì)粒類型的測序模板一般有兩種原因可以造成模板污染。一為所挑選的克隆不純,包含兩種或兩種以上的克隆,如不包含插入片段的克隆和包含插入片段的克隆的混合體,用T載體

12、進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí),正向插入的克隆和反向插入的克隆的混合體等。通常重新挑選獨(dú)立的克隆可以解決該問題。第二種情況是一些產(chǎn)量很低的質(zhì)粒,測序時(shí)需要加入較多體積的模板,因此相應(yīng)包含的雜質(zhì)就要多了,這些增加的雜質(zhì)對測序?qū)a(chǎn)生極大的影響。通常我們要求質(zhì)粒的產(chǎn)量要達(dá)到每毫升菌液能夠提取到至少200 ng的質(zhì)粒,低于此產(chǎn)量的質(zhì)粒用于測序成功率將大大下降。對于低產(chǎn)量的質(zhì)粒,一般讓客戶自己采取大量提取的方法,拿到足夠用于測序的量的質(zhì)粒,最少1ug。圖11 PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果,該結(jié)果信號很強(qiáng),峰型整齊,但是在該測序結(jié)果中有多個(gè)位置有重疊峰,出現(xiàn)N值。造成該情況的主要原因很可能是該P(yáng)CR產(chǎn)物中有突變體的存在。在每個(gè)突變位點(diǎn)上有一個(gè)重疊的峰,由于儀器無法正確識別該處的堿基,就只能以N值代替。在有的測序結(jié)果中,整條序列信號很好,在個(gè)別位置有N值,一定要確認(rèn)該處N值的具體情況,如果卻是兩個(gè)重疊峰存在,重新測序也解決不了問題。                           

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